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Detección, transmisión y caracterización del fitoplasma asociado a la enfermedad del decaimiento del peral

by García Chapa, Meritxell

Abstract (Summary)
Se ha realizado una prospección en 1500 parcelas de cultivo de peral, para evaluar la extensión de la enfermedad del Decaimiento del peral (PD) en el Nordeste de España. Un 7% de las parcelas observadas presentaron síntomas de la enfermedad. Paralelamente, se ha evaluado la incidencia de la enfermedad en 45 de estas parcelas, por inspección visual de 500 árboles, en cada una de ellas. La presencia del fitoplasma fue confirmada mediante nested-PCR. Finalmente, la caracterización del fitoplasma, indicó que la enfermedad estaba causada por un único fitoplasma, el fitoplasma de PD. Se ha evaluado la expresión de síntomas de la enfermedad de PD a lo largo del año, en tres variedades distintas. Cada variedad presentó unos síntomas asociados característicos, hecho que puede ser de utilidad en nuevas prospecciones. La presencia del fitoplasma se ha examinado mediante la técnica de nested-PCR en un total de 43 árboles. En los tres casos, la máxima detección del fitoplasma fue alcanzada en Diciembre. Paralelamente, en este estudio se ha analizado qué parte de la planta (nervios, yemas o tallo) era la más adecuada para realizar una detección del fitoplasma mediante PCR. Se obtuvo la detección más fiable en tallo. Finalmente, se ha examinado el estado funcional del fitoplasma de PD durante el invierno, mediante transmisión del fitoplasma por injerto a perales sanos. Los resultados demostraron que el fitoplasma puede permanecer en estado funcional en la parte aérea del árbol durante la fase de hibernación. Se ha estudiado el papel de Cacopsylla pyri (Homoptera; psyllidae) en la transmisión del fitoplasma del Decaimiento del peral (PD) en el Nordeste de España. Los resultados obtenidos demostraron que C. pyri transmite el fitoplasma a peral y medios artificiales, y por tanto es, como en otros países del área mediterránea, vector de la enfermedad en España. Los porcentajes de psilas infectadas fueron similares entre sexos, sin embargo las hembras transmitieron el fitoplasma en mayor porcentaje que los machos. Por último, se ha puesto a punto una técnica para separar el ADN del genoma de los fitoplasmas, del de las plantas que los hospedan, gracias al alto contenido en A+T de los fitoplasmas en comparación con el de las plantas huésped. Los resultados muestran que un 90% de los clones recombinantes contenían ADN de fitoplasma. Por secuenciación y comparación con el banco de datos de NCBI fue confirmado el origen bacteriano de las secuencias, Finalmente mediante el diseño de cebadores para alguna de estas secuencias y posterior análisis por PCR se corroboró que los fragmentos de ADN clonados eran fitoplasmáticos. La técnica de dot.blot ha sido utilizada para detectar el fitoplasma del Decaimiento del peral (PD) con secuencias de ADN no ribosómicas. Para este propósito, se escogieron 2 fragmentos obtenidos a partir de la técnica anterior y fueron marcados con digoxigenina y empleados como sondas, para hibridar con extractos de ADN de perales y psilas infectados con este microorganismo. El fitoplasma de PD se detectó en ambos extractos. Se han realizado también ensayos para evaluar la sensibilidad de estas sondas en la detección del fitoplasma de PD. Para ello, se analizaron extractos de ADN de psilas, por nested-PCR e hibridación por dot.blot. Los resultados obtenidos fueron similares con ambas técnicas. Por ello, se propone la hibridación ADN / ADN como una alternativa a la PCR, Por último, el ADN de diferentes fitoplasmas, se ha utilizado para determinar si los cebadores diseñados para estos dos fragmentos eran específicos para el fitoplasma de PD, o amplificaban secuencias de otros fitoplasmas. Al obtenerse una banda específica con ADN del fitoplasma de la Proliferación del manzano (AP) y con el del PD, se confirma la relación filogenética existente entre ambos.
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Bibliographical Information:

Advisor:Batlle, Assumpció

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:408 departament de biologia cel lular i fisiologia

ISBN:

Date of Publication:03/30/2004

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