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Identificación y caracterización de la caja SOS de Ralstonia metallidurans y de Deinococcus radiodurans

by Casares Proaño, Lorena Cecilia

Abstract (Summary)
El sistema SOS de Escherichia coli ha sido durante mucho tiempo el modelo de referencia para su estudio en otras especies. Este sistema se encuentra en otros microorganismos incluyendo bacterias gramnegativas, grampositivas y otras. Recientemente se han encontrado diferencias entre las cajas SOS y los genes que integran el regulón SOS de E. coli con respecto a otras especies bacterianas. El propósito de este trabajo ha sido determinar y caracterizar las cajas SOS de dos especies bacterianas, Ralstonia metallidurans y Deinococcus radiodurans, pertenecientes a los grupos b-Proteobacterias y Deinococcus-Thermus, respectivamente. En primer lugar se realizó la clonación y secuenciación de los genes recA y lexA de R. metallidurans, el primero mediante hibridación con una sonda del gen recA de Agrobacterium tumefaciens y el segundo utilizando programas informáticos en los que se usó la secuencia del gen lexA de E. coli para identificar dicho gen en la secuencia parcial del genoma de R. metallidurans. Tras un análisis de sus regiones promotoras, se determinó que ambas contenían un motivo regulador, CTGT-N8-ACAG, idéntico al de E. coli. Se comprobó que esta caja reguladora era funcional tanto en R. metallidurans como en E. coli, evaluando su capacidad de inducir el gen recA frente a lesiones en el DNA. Adicionalmente se determinó que la caja SOS de este microorganismo se encontraba en varios genes que, en E. coli forman parte del regulón SOS, como recA, lexA y un hipotético gen de la familia impB/samB/mucB. En cambio, no se identificó dicha caja en los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG, los cuales, en E. coli, también integran el regulón SOS. Mediante el análisis cuantitativo por RT-PCR on-line de los tránscritos se demostró que la expresión de todos estos genes era inducible al lesionar el DNA. Asimismo, mediante ensayos de movilidad electroforética, utilizando extractos proteicos de LexA de E. coli purificada y extractos crudos de R. metallidurans y R. metallidurans LexA(Def), se determinó que la proteína LexA era la responsable de la regulación de los genes recA, lexA y el hipotético gen de la familia impB/samB/mucB. Por el contrario, los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG no están bajo el control de la proteína LexA. Por lo tanto, si bien R. metallidurans posee una caja SOS idéntica a la de E. coli, solo algunos de los genes integrados en el regulón SOS de E. coli forman parte de este regulón en R. metallidurans. Además, el hecho de que los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG sean inducibles por lesiones en el DNA indica que deben estar sometidos a algún control independiente de LexA. Para determinar la caja SOS de D. radiodurans, se procedió a clonar el gen lexA obteniéndose su secuencia mediante programas informáticos que permiten localizar secuencias de un genoma con un determinado grado de similitud a otras secuencias conocidas. Una vez clonado dicho gen, se sobreexpresó la proteína LexA de este microorganismo y el extracto proteico obtenido se utilizó para realizar ensayos de movilidad electroforética frente al promotor del gen lexA de D. radiodurans, demostrándose que el gen lexA se autorregula. Seguidamente y mediante ensayos de movilidad electroforética se acotó al máximo la región promotora del gen lexA hasta identificar un posible motivo regulador. Mediante mutagénesis dirigida de las diferentes bases de dicho motivo se determinó que la proteína LexA de D. radiodurans reconoce específicamente el palíndromo CTTG-N8-CAAG como motivo de unión, siendo las bases señaladas en negrita las más importantes para la unión proteína-DNA. Finalmente se demostró que otros genes como recA o el hipotético lexA2 no tienen la misma caja SOS ni son regulados por LexA. Se concluye que la proteína LexA de D. radiodurans tiene un motivo regulador diferente a los anteriormente descritos para otros grupos de microorganismos y que debe haber un tipo de regulación diferente a los anteriormente descritos para los genes involucrados en procesos reparativos.
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Bibliographical Information:

Advisor:Llagostera Casas, Montserrat

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:409 departament de genetica i microbiologia

ISBN:

Date of Publication:06/26/2003

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