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Expresión recombinante en E. Coli de antígenos de Actinobacillus Pleuropneumoniae para vacunación y diagnóstico

by Medrano Muñoz, Andrés

Abstract (Summary)
Actinobacillus pleuropneumoniae es una bacteria gramnegativa que provoca la pleuroneumonía porcina. En este trabajo se ha procedido a la producción y purificación, mediante técnicas de biología molecular, de antígenos proteicos de esta bacteria y a su uso en la formulación de una vacuna por subunidades y de un ELISA para diagnóstico. Los cuatro antígenos escogidos fueron dos proteínas de membrana externa (Tbp1 y Tbp2) y dos exotoxinas (ApxI y ApxIII). La primera necesidad consistía en localizar y secuenciar el gen tbp1 en el genoma de A. pleuropneumoniae. Para la detección de tbp1 se clonó el gen tbp2, situado en posición 5 respecto del gen tbp1, y se utilizó como sonda. Tras su identificación, el gen tbp1 fue clonado en el vector pUC119 y se obtuvo su secuencia completa, ésta se depositó en el Genbank con el código de acceso Z49708, habiéndose obtenido su patente europea EP0733708 y americana 08/624655. Finalmente, el resultado de este primer apartado fue publicado (Daban et al., 1996; Medrano et al., 1997) (Anexos VII.1 y VII.2). Por otro lado, para la clonación de los genes apxIa y apxIIIa se utilizó una estrategia diferente. Al estar publicadas sus secuencias, se diseñaron cebadores de PCR en los cuales se introdujeron mutaciones que creaban dianas de restricción, permitiendo así la amplificación sobre el genoma y posterior clonación en vectores de expresión. Una vez clonados los genes codificantes para las cuatro proteínas se pasó a la producción heteróloga en Escherichia coli. Para ello se utilizaron diversos vectores: pMAL, que generan como producto de expresión una proteína de fusión con la MBP (maltose binding protein) y vectores de la gama pET, con los cuales se ha desarrollado la mayor parte del trabajo. En ellos se han clonado y producido los cuatro antígenos en diversas construcciones, tanto las proteínas completas como péptidos de las mismas. A partir de los extractos obtenidos se procedió a la purificación de los antígenos por cromatografía de afinidad aprovechando fusiones con colas de histidinas. Tras producir y purificar los cuatro antígenos (ApxI, ApxIII, Tbp1 y Tbp2) a escala de laboratorio, se procedió a la elaboración de una vacuna experimental. Se desarrollaron tres protocolos de vacunación sobre cerdos libres de anticuerpos frente a A. pleuropneumoniae. Se estudió la inocuidad y efectividad de esta vacuna. Se determinó la respuesta humoral a partir de las muestras de suero obtenidas en los ensayos de vacunación mediante técnicas de transferencia Western-blot y de ELISA indirecto. Utilizando estas muestras y otras baterías de sueros de campo de animales con historias clínicas diversas se ha desarrollado un kit de ELISA indirecto para la detección de anticuerpos frente a A. pleuropneumoniae. Los antígenos que se utilizan para la preparación de este ELISA son la Tbp2 y la ApxI producidas de forma recombinante. Este kit se comercializa actualmente bajo el nombre de CIVTESTSUISAPP.
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Bibliographical Information:

Advisor:Querol Murillo, Enrique; Daban Marín, Montserrat

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:04/04/2003

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