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Cisteína-proteinases em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis. Cysteine-proteinases in promastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis.

by Rebello, Karina Mastropasqua

Abstract (Summary)
No presente trabalho foram detectadas cisteína-proteinases (CPs) em promastigotas infectivas de Leishmania (Viannia) braziliensis. A estratégia de purificação consistiu na associação do método de extração por Triton X-114 com cromatografia em coluna de Concanavalina A-Sepharose, seguida por outra de DEAE-Sephacel. No ensaio das cromatografias, observamos um pico majoritário de atividade enzimática na presença do substrato pEFLpNan (165 x 10-32 amp;#956;M de pNan/minuto) para cerca de 1010 parasitas, coincidente com o pico majoritário da proteína eluído da coluna de troca iônica. A análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de troca iônicamostrou quatro principais bandas de proteínas com massas moleculares relativas de 63, 43, 30 e 27 kDa. Os ensaios da atividade enzimática após eletroforese mostraram que as bandas de 63 kDa e 43 kDa, hidrolisam substratos como gelatina em pH 7,0 e são sensíveis à presença de E-64.Além disso, as duas enzimas são capazes de hidrolisar o substrato pEFLpNan: 63 kDa (2,2 ± 0,3 amp;#956;M de pNan/minuto) e 43 kDa (0,05 ± 0,2 amp;#956;M de pNan/minuto), e são inibidas por10amp;#956;M E-64 (47 % e 36 %, respectivamente). Os ensaios de reconhecimento imunológico utilizando um anti-soro policlonal específico contra cisteína-proteinase B [anti-CPB de L. (L.)mexicana] revelaram que as enzimas de 63 kDa e 43kDa são reconhecidas por este anti-soro. Os experimentos de aglutinação, citometria de fluxo e imunocitoquímica utilizando esse mesmo antisoro revelaram que homólogos de CPBs estão localizados na superfície da membrana de promastigotas. Além disso, a incubação dos promastigotas com fosfolipase C (PLC) reduziu o número de células positivas para os homólogos de CPB. Os anti-soros anti-CRD (cross reactive determinat) e anti-CPB reconhecem bandas de 63 kDa e 43 kDa do sobrenadante das células tratadas com PLC em ensaios de immunoblotting sugerindo que isoformas destas proteínas sãoancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI) à membrana plasmática. Também observamos que os homólogos de CPBs são presos a membrana por âncora GPI e se concentram em plataformas lipídicas. Nós observamos que as proteínas homólogas a CPB não permanecem estáveis nasuperfície da membrana quando os parasitas são mantidos em culturas sucessivas, assim como a atividade enzimática total sobre o substrato pEFLpNan é alterada. Mostramos ainda através da técnica RT-PCR em tempo real um aumento da transcrição de cpb de L. (V.) braziliensis quando os parasitas foram submetidos a culturas sucessivas. De uma forma geral os dados apresentados suportam a hipótese de que o parasita estudado apresentam CPs de membrana ativas, além dehomólogos de CPB intracelulares.
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Bibliographical Information:

Advisor:Carlos Roberto Alves

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords: Reação em Cadeia da Polimerase Leishmaniose

ISBN:

Date of Publication:04/10/2008

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