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Análisis mutacional del extremo c-terminal de la ?-1,3-galactosiltransferasa bovina: estabilidad y catálisis

by Linares Pastén, Javier Antonino

Abstract (Summary)
RESUMEN La ?-1,3-galactosiltransferasa (?3GT) está involucrada en la biosíntesis de oligosacáridos antigénicos responsables del rechazo inmunológico hiperagudo (HAR) en el xenotransplante de órganos de animales a humanos, por lo que esta enzima tiene un particular interés en biomedicina. Por otra parte, la ?3GT constituye un modelo enzimático para estudios mecanísticos y estructurales de glicosiltransferasas. La enzima transfiere galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac). Actualmente, los estudios cristalográficos han mostrado dos tipos de estructuras con diferentes conformaciones en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, esta zona está altamente desordenada, pero en la forma II está bien definida, lo cual sugiere que funciona como tapa que cierra el sitio catalítico. Estos cambios conformacionales sugieren que el extremo C-terminal podría tener un rol clave en la actividad catalítica. En la presente tesis doctoral se abordó el estudio estructural/funcional del extremo C-terminal desde un enfoque de análisis cinético y de estabilidad de mutantes de alanina de cada uno de los aminoácidos de las posiciones 358-368. De esta manera, la comparación entre eficiencia catalítica y estabilidad enzimática proporcionan un método que permite identificar los aminoácidos que tienen un rol importante en la unión de ligando o en el empaquetamiento estructural. Para los mutantes K359A, Y361A, V363A y R365A no se ha detectado actividad, por lo cual estas posiciones son fundamentales para la actividad de ?3GT. K359, Y361 y R365 interaccionan con los fosfatos del UDP-Gal, además, K359A también interaccionan con el hidroxilo 3 de la lactosa según modelización molecular, por lo cual se ha propuesto un rol de ácido/base general a la lisina 359. Por otra parte, los mutantes N367A y V368A resultaron ser de 2 a 3 veces más activos que wt, respectivamente. Los estudios de estabilidad revelan que wt y mutantes de residuos no involucrados directamente en la interacción con los sustratos, presentan mayor estabilidad que aquellos que según los modelos moleculares y las estructuras cristalográficas interaccionan directamente con el UDP o UDP-Gal. Por otra parte, se encontró que la presencia de UDP disminuye en mutantes de residuos directamente implicados en las interacciones con el UDP-Gal.
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Bibliographical Information:

Advisor:Planas Sauter, Antoni

School:Universitat Rovira i Virgili

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:iqs química orgànica i bioquímica

ISBN:

Date of Publication:09/12/2007

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