Análisis mutacional del extremo c-terminal de la ?-1,3-galactosiltransferasa bovina: estabilidad y catálisis

by Linares Pastén, Javier Antonino

RESUM La ?-1,3-galactosiltransferasa (?3GT) està involucrada en la biosíntesis doligosacàrids antigènics responsables del rebuig immunològic hiperagut (HAR) en el xenotransplant dòrgans danimals a humans, per la qual cosa aquesta enzima té un particular interès en biomedicina. Per altra banda, la ?3GT constitueix un model enzimàtic per a estudis mecanístics i estructurals de glicosiltransferasas. Lenzim transfereix galactosa (Gal) del UDP-Gal a la N-acetillactosamina (LacNAc), o a la lactosa (Lac). Actualment, els estudis cristalogràfics han mostrat dos tipus destructures amb diferents conformacions en la zona C-terminal (aa.358-368). En la forma I, aquesta zona està altament desordenada, però en la forma II està ben definida, la qual cosa suggereix que funciona com a tapa que tanca el lloc catalític. Aquests canvis conformacionals suggereixen que lextrem C-terminal podria tenir un rol clau en lactivitat catalítica. En la present tesis doctoral es va abordar lestudi estructural/funcional de lextrem C-terminal des dun enfocament danàlisi cinètic destabilitat de mutants dalanina de cadascun dels aminoàcids de les posicions 358-368. Daquesta manera, la comparació entre eficiència catalítica i estabilitat enzimàtica proporcionen un mètode que permet identificar els aminoàcids que tenen un paper important en la unió de lligand o en lempaquetament estructural. Pels mutants K359A, Y361A, V363A y R365A no sha detectat activitat, per la qual cosa aquestes posicions són fonamentals per a lactivitat ?3GT. K359, Y361 i R365 interaccionen amb els fosfats del UDP-Gal, a més, K359A també interacciona amb lhidroxil 3 de la lactosa segons modelització molecular, per la qual cosa sha proposat un paper dàcid/base general a la lisina 359. Per altra banda, els mutants N367A i V368A van resultar ser de 2 a 3 vegades més actius que wt, respectivament. Els estudis destabilitat revelen que wt i mutants de residus no involucrats directament en la interacció amb els substracts, presenten major estabilitat que aquells que segons els models moleculars i les estructures cristallogràfiques interaccionen directament amb el UDP o UDP-Gal. Per altra banda, es va trobar que la presència de UDP disminueix en mutants de residus directament implicats en les interacciones amb el UDP-Gal.