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Caracterización molecular y fenotípica del género pseudallescheria y géneros afines

by Gilgado Barbadilla, Felix

Abstract (Summary)
Título Tesis Doctoral: Caracterización molecular y fenotípica del género Pseudallescheria y géneros afines Autor: Fèlix Gilgado Barbadilla Afiliación: Unitat de Micologia, Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques. Facultat de Medicina. URV Resumen Pseudallescheria es un género de ascomicetos caracterizado por ser polimórfico, ya que pueden presentar hasta tres formas morfológicamente diferentes, una forma sexual o teleomorfo y dos formas asexuales o anamorfos (sinanamorfos). Estas dos formas asexuales se clasifican en los géneros anamórficos Scedosporium y Graphium. Pseudallescheria boydi es la especie más importante del género debido a que es considerado un hongo patógeno emergente capaz de producir infecciones graves especialmente en pacientes inmnusuprimidos. Hasta la presente tesis, el anamorfo de P. boydii era Scedosporium apiospermum. En los últimos años, P. boydii ha sido objeto de diversos estudios moleculares que han mostrado su elevada variabilidad intraespecífica. Otros trabajos han puesto de relieve su variabilidad en cuanto a la respuesta a los antifúngicos así como la diferente virulencia que existe entre sus cepas. Todo ello hacía suponer que en lugar de una sola especie nos hallábamos frente a un complejo de especies. Por esta razón decidimos realizar un estudio molecular y morfológico utilizando numerosas cepas tanto clínicas como ambientales y de diferentes países. Gran parte de las cepas ambientales fueron aisladas por nosotros con la utilización del medio selectivo DRBC con benomilo. El análisis de secuencias parciales del gen de la ?-tubulina (dos loci) y la calmodulina y las regiones ITS del ADNr demostraron que P. boydii es un complejo de especies. El análisis combinado de las secuencias de los 4 loci nos permitió la distinción de 8 especies filogenéticas agrupadas en 4 clados diferentes. Los clados 1 y 2 fueron descritos como las nuevas especies Scedosporium aurantiacum y Pseudallescheria minutispora, respectivamente. El clado 5 consistió en 4 subgrupos incorporando las cepas tipos de P. boydii Pseudallescheria angusta, Pseudallescheria ellipsoidea y Pseudallescheria fusoidea. En el caso de los clados 3 y 4 fueron considerados únicamente como especies filogenéticas en este primer estudio. Posteriormente, para facilitar la identificación de estas 8 especies filogenéticas en laboratorios de microbiología clínica, se estudiaron las características morfológicas macro- y microscópicas mas representativas de todas ellas así como su respuesta a 59 pruebas fisiológicas. Para incrementar la robustez de los diferentes clados, aumentamos el número de nuevos aislados y de éstos se secuenció la región TUB del gen de la ?-tubulina, el cual previamente demostró ser el marcador molecular más informativo de los 4 evaluados. La combinación de estos estudios permitió distinguir fenotípicamente las mencionadas especies filogenéticas. La nueva especie Scedosporium dehoogii (previamente clado 3) fue descrita y Scedoporium apiospermum (previamente clado 4) y P. boydii fueron consideradas como dos especies diferentes. El nuevo nombre Scedosporium boydii fue propuesto para denominar al anamorfo de la última especie. Scedosporium dehoogii pudo ser separada del resto porque no crece a 40ºC y presenta conidioforos no ramificados. Aunque S. apiospermum fue morfológicamente indistinguible del anamorfo de P. boydii ambas especies pudieron ser separadas por su respuesta a las pruebas de la D-ribosa y por la presencia o ausencia de teleomorfo. Durante la búsqueda de nuevos aislados utilizando el medio DRBC suplementado con benomilo, aislamos un hongo interesante de suelo de Argentina que presentaba una morfología similar a la de Scedosporium. Un estudio más detallado a nivel genético y morfológico nos permitió ver que este hongo era diferente a las especies conocidas de éste y otros géneros relacionados, por lo que propusimos el nuevo género Parascedosporium. Su carácter distintivo es el desarrollo simpodial de los conidios a partir de células conidiógenas denticuladas. Este aislado resultó ser morfológicamente idéntico a Graphium tectonae, por lo que propusimos la nueva combinación Parascedosporium tectonae. El análisis filogenético de las secuencias de 4 regiones de los 3 genes ya trabajados en el primer estudio confirmó nuestra propuesta. En esta tesis también evaluamos la actividad in vitro de 11 antifúngicos (anfotericina B, albaconazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol, terbinafina, micafungina y flucitosina) utilizando el método de microdilución del CLSI contra 84 aislados pertenecientes a las 8 especies que constituyen el complejo P. boydii. Encontramos diferencias significativas entre las especies, siendo Scedosporium aurantiacum la más resistente. En general, el voriconazol fue el antifúngico más activo, seguido del posaconazol. Otro objetivo de la presente tesis fue comparar la virulencia de alguna de las diferentes especies del complejo utilizando un modelo murino con animales inmunocompetentes e inmunosuprimidos. Se seleccionaron 2 inóculos diferentes, 5x104 conidia/mL (para los animales inmunosuprimidos) y 1x106 conidia/mL (para los animales inmunocompetentes). S. aurantiacum y S. dehoogii fueron significativamente las especies más virulentas, causando la muerte del 80% y 70% de los ratones inmunocompetentes, respectivamente, mientras que el resto de las especies sólo consiguió entre un 0% y un 20% de mortalidad. Finalmente, debido a que ninguna de las cepas estudiadas de la especie más común del complejo, S. apiospermum, había desarrollado la forma sexual, consideramos interesante determinar si se trataba de una especie heterotálica. Para ello, realizamos cruzamientos con 15 cepas de S. apiospermum en todas las combinaciones posibles, incluyendo cruzamientos consigo misma. Algunos cruzamientos entre distintas cepas produjeron ascomas fértiles, mientras que los cruzamientos con subcultivos de una misma cepa resultaron autoestériles. Las cepas pudieron separarse en dos diferentes mating types. Corroboramos el bi-alelismo del sistema de cruzamiento heterotálico mediante cruzamientos entre las ascosporas de la progenie F1 de un cruzamiento positivo. Todos estos datos confirmaron que S. apiospermum es una especie heterotálica.
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Bibliographical Information:

Advisor:Gené Díaz,Josepa; Cano Lira, jose Franisco; Guarro Artigas, Josep

School:Universitat Rovira i Virgili

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:departament de ciències mèdiques bàsiques

ISBN:

Date of Publication:10/18/2007

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