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Caracterització molecular de subunitats reguladores de la fosfatasa Ppz1 en el llevat saccharomyces cerevisiae

by Muñoz Muñoz, Ivan

Abstract (Summary)
La fosfo-defosforilación de aminoácidos es uno de los procesos de regulación reversible más extendidos en los seres vivos. Este tipo de reacciones es llevado a cabo por la acción opuesta de las proteínas quinasas y las proteínas fosfatasas. A pesar de ello, el genoma de la levadura codifica un número mayor de Ser/Thr quinasas. Por ello, algunas fosfatasas han desarrollado un mecanismo de regulación distinto, que se basa en la unión de la subunidad catalítica a una o más subunidades reguladoras. Éstas determinan la localización subcelular, la especificidad por el sustrato y, en definitiva, la función de la fosfatasa. Éste es el caso de la fosfatasa de tipo 1, que está codificada por GLC7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae, un enzima esencial que desarrolla funciones muy importantes en la biología de la célula y cuya función está regulada por la unión de la subunidad catalítica a multitud de subunidades reguladoras distintas. El genoma de la levadura codifica dos fosfatasas, conocidas con el nombre de Ppz1 y Ppz2 y cuya mitad carboxiterminal está relacionada estructuralmente con Glc7. A pesar de no ser esenciales, estas fosfatasas desarrollan un papel importante en la biología de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En concreto, ejercen un control negativo sobre la tolerancia salina y la progresión del ciclo celular y positivo en el mantenimiento de la integridad celular. En el momento de iniciar este trabajo sólo se conocía una subunidad reguladora de estas fosfatasas, conocida con el nombre de Hal3 o Sis2. Esta proteína actúa como inhibidora de todas las funciones conocidas de Ppz1. Sin embargo, su mecanismo de actuación es desconocido. El primer objetivo de este trabajo ha sido intentar profundizar en la regulación que lleva a cabo la fosfatasa Ppz1 en el control del ciclo celular de la levadura. Para ello, se ha generado un doble mutante condicional sit4 hal3 que presenta una parada entre las fases G1 y S del ciclo. Esta cepa se ha transformado con dos genotecas multicopia diferentes. Gracias a ello se han podido aislar una serie de genes que, en multicopia son capaces de suprimir el fenotipo de esta cepa. Entre ellos se encuentran elementos reguladores del ciclo celular ya conocidos, algunas fosfatasas, elementos involucrados en homeostasis salina y tres genes cuya función era desconocida por el momento, que han sido renombrados VHS1, VHS2 y VHS3. En segundo lugar, se ha investigado el mecanismo de acción de Hal3 sobre la fosfatasa Ppz1. Para ello se han estudiado elementos hallados en la secuencia de Hal3 posiblemente relevantes para la función de esta proteína. Además, se ha realizado una estrategia de mutagénesis al azar de la zona más conservada de Hal3 seguida de una búsqueda de pérdida de función. Esto ha permitido hallar una serie cambios aminoacídicos únicos que interfieren en la función de Hal3. La caracterización bioquímica posterior ha permitido determinar dos regiones en la secuencia de Hal3 importantes para la unión a Ppz1 y una tercera región importante para inhibir a la fosfatasa. Finalmente, se ha estudiado el papel biológico de YFR003c, un ORF cuya función era desconocida por el momento. Estos estudios han demostrado que codifica una proteína con características afines a los inhibidores de la fosfatasa de tipo 1 humana. Además, se ha podido demostrar que Yfr003c es capaz de unirse e inhibir in vitro a Glc7 y, con menor eficiencia, a Ppz1. Estudios posteriores in vivo refuerzan la hipótesis del papel de Yfr003c como inhibidor de Glc7. Por este motivo, ha recibido el nombre de Ypi1 (Yeast Phosphatase 1 Inhibitor) y se ha propuesto como el primer inhibidor conocido de Glc7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae.
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Bibliographical Information:

Advisor:Ariño Carmona, Joaquim

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:12/03/2004

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