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Distribución intracelular de la anexina A6: implicaciones funcionales

by Diego Martínez, Iñaki de

Abstract (Summary)
RESUMEN: Las proteínas de la familia de las anexinas se caracterizan su unión a los fosfolípidos de la bicapa lipídica de forma dependiente de calcio, a través de los motivos repetición anexina presentes en su secuencia. Esta capacidad ha sido descrita mediante ensayos in-vitro, aunque poco se conoce de la funcionalidad de este comportamiento en los sistemas biológicos. Además del calcio, otros componentes celulares, como el citoesqueleto de actina, podrían modular in-vivo la unión de anexinas a las membranas biológicas. En trabajos previos nuestro grupo determinó in-vivo como la anexina A6 era capaz de reclutarse hacia el compartimento endocítico en paralelo a la internalización de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), uno de cuyos componentes mayoritarios es el colesterol. En el presente trabajo describimos como el colesterol por si sólo es capaz de inducir este reclutamiento, de forma independiente de calcio. En primer lugar, se determinó que existía una población de anexina A6, asociada a membranas (totales o endosomales) aisladas en ausencia de calcio, y que ésta era liberada al solubilizar el colesterol presente en la bicapa (con digitonina). Además, la acumulación de colesterol en el compartimento endocítico tardío (mediante el tratamiento de las células con la droga U18666A) inducía el reclutamiento in-vivo de anexina A6 hacia éstas membranas, proceso observado mediante fraccionamiento celular (aislamiento de endosomas e immunodetección por western blot) e immunocitoquímica (co-localizando, en estos endosomas a la anexina con el lípido no esterificado -marcado con filipina-). El incremento de la asociación colesterol-dependiente se observó asimismo para la anexina A6 añadida de forma exógena (a membranas aisladas carentes de anexina endógena) descartando la afectación del tráfico intracelular como causa del efecto observado. A continuación se determinó la funcionalidad derivada de la interacción de otro tipo de lipoproteínas involucradas en el metabolismo de colesterol, las HDL (de alta densidad), con la superficie de células CHO. Describimos la activación de Ras de forma subsiguiente a la unión de la partícula a la membrana. involucrando a uno de sus receptores más importantes, el Scavenger Receptor Type B-I (SR-BI). Al estudiar el efecto de la sobreexpresión de anexina A6 sobre esta señalización a partir de las HDL y su receptor SR-BI, en células CHO, se observó una disminución de la activación de Ras y Raf (pero no del resto de MAPKs). Por otro lado, la observación in-vivo (videomicroscopía) de la distribución celular de anexina A6-GFP sobreexpresada en células CHO, muestra como incrementos del calcio intracelular ejercen un reclutamiento masivo y muy rápido de la anexina A6 hacia la membrana plasmática (o dominios subyacentes a ésta), siguiendo un patrón similar al observado para algunas GAPs (GTPase activating proteins). Esta observación, así como la interacción ya descrita in-vitro entre la anexina A6 y p120GAP, sugiere la hipótesis que la translocación calcio-dependiente de la anexina hacia la membrana modularía la concentración de p120GAP, colaborando así en la desactivación de Ras. En este sentido, observamos como la sobreexpresión de anexina A6 induce, en células CHO, un incremento de la asociación de p120 GAP a fracciones de membrana enriquecidas en Ras. La caracterización de estos dominios de concentración de anexina A6 en la membrana indica que se trata de lipid rafts (dominios enriquecidos en colesterol) con presencia de citoesqueleto de actina. Postulamos que, en la célula viva, el calcio, el colesterol y el citoesqueleto de actina colaboran determinando la localización de la anexina en la membrana, desde donde actuaría como un modulador de la señalización a través de Ras.
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Bibliographical Information:

Advisor:Enrich Bastús, Carles

School:Universitat de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:biologia cel·lular i anatomia patològica

ISBN:

Date of Publication:12/17/2004

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