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Organização genomica das sequencias subtelomericas (TAS - "Telomere associated sequences") de Leishmania (Leishmania) amazonensis e identificação de proteinas que reconhecem especificamente estas sequencias

by Conte, Fabio Frangiotti

Abstract (Summary)
Os telômeros são complexos de DNA e proteínas que protegem os cromossomos eucarióticos da degradação e fusão terminais, garantindo a estabilidade genômica. As seqüências teloméricas são ricas em guaninas e na maioria dos eucariotos terminam em uma protrusão 3' simples fita denominada de "3'G-overhang". As seqüências adjacentes aos telômeros constituem a região subtelomérica, a qual em Leishmania spp., diferentemente de Trypanosoma cruzi, T. brucei e Plasmodium falciparum, não contém genes que codificam antígenos de superfície. Fu & Barker (1998) caracterizaram essa região em diferentes espécies do gênero Leishmania e verificaram que a mesma possui blocos de uma sequência de 100 pb conhecida como "Leishmania Conserved Telomere Associated Sequences" (LCT AS), a qual aparece flanqueada por repetições teloméricas. Há dois blocos de seqüências conservadas (CSBl e CSB2) que fazem parte das LCTAS e que têm diferente organização e número de cópias na região subtelomérica (Fu & Barker, 1998). Devido ao alto grau de conservação das seqüências desses elementos, sugere-se que estes desempenhem função importante no processo de segregação dos cromossomos e que possam conter sítios para ligação de proteínas do complexo telomérico. O intuito principal deste projeto de Mestrado foi estudar a organização genômica de seqüências da região teloméricalsubtelomérica de Leishmania amazonensis. A partir dos resultados dos "Southem blottings" e dos ensaios de cinética de digestão com a exonuclease Bal31 foi possível estimar que os Fragmentos de Restrição Terminais (TRF "Terminal Restriction Fragments") de L. amazonensis possuem aproximadamente 3,3 kb e que o tamanho médio dos telômeros varia de 0,2 a 1,0 kb. Além disso, as hibridizações com as seqüências CSBl e CSB2 das LCTAS revelaram que esses domínios aparecem como blocos de 0,2 a 1,6 kb, flanqueados por sítios HaeIII, e que CSB 1 e CSB2 encontram-se em menor número de cópias em relação à seqüência telomérica. Demonstrou-se também que há sítios HinjI presentes nas regiões subteloméricas da maioria dos cromossomos, assim como sítios AfaI em posição distal e próximos ao término dos cromossomos. Utilizando-se "Southem blotting" não denaturante, estimou-se o tamanho e a seqüência da protrusão "3'G-overhang" dos cromossomos de L. amazonensis. Essa estrutura possui 2: 12 nucleotídeos e difere das outras espécies do gênero Leishmania por apenas três nucleotídeos na extremidade 3' . Para confirmar os resultados acima, realizou-se a hibridização com as seqüências telomérica e subteloméricas dos cromossomos de L. amazonensis separados por PFGE. Os cromossomos foram separados em 25 bandas coradas com brometo de etídeo com pesos moleculares variando de 0,35 2: 3,0 Mb. Todas as bandas hibridizaram com as seqüências telomérica e subtelomérica, indicando que as mesmas são moléculas lineares. Os experimentos de PFGE em segunda dimensão foram usados com o objetivo de se analisar a organização dessas seqüências nos cromossomos e demonstraram que a maioria dos telômeros de L. amazonensis são polimórficos em tamanho. Um modelo hipotético para essa organização foi proposto. Os ensaios de "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) e "UV cross-linking" foram utilizados para identificar proteínas formadoras de complexos com os elementos subteloméricos conservados e com a repetição telomérica na forma de dupla-fita. Resultados preliminares demonstraram a existência de três complexos DNA-proteína denominados LaCIF para "Leishmania CSB2 Interacting Factor" e LaTAFI-2 para "Leishmania Telomere Associated Factor 1 and 2". Todos os complexos foram formados com proteínas presentes em extratos S1OO e nuclear e com sondas na forma de dupla-fita. Nenhum complexo foi formado quando se utilizou a seqüência CSB 1 como sonda. Os resultados obtidos neste projeto, apesar de preliminares, poderão contribuir para uma maior compreensão sobre a organização estrutural e sobre a composição da cromatina na região teloméricalsubtelomérica de L. amazonensis, o principal agente etiológico da leishmaniose cutânea e cutâneo-difusa no Brasil
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Bibliographical Information:

Advisor:Maria Isabel Nogueira Cano; Maria Isabel Nogueira Cano [Orientador]; Lucio Holanda de Freitas-Junior; João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa; Gonçalo Amarante Guimarães Pereira

School:Universidade Estadual de Campinas

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Leishmaniose

ISBN:

Date of Publication:12/17/2004

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