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Regeneração e infecção por Agrobacterium tumefaciens emexplantes de Tabaco(Nicotiana tabacum L.) cv. SR1

by Coutinho, Camila Medeiros

Abstract (Summary)
A moderna biotecnologia molecular permite a produção de várias proteínasrecombinantes em diferentes sistemas de expressão. A produção de vacinas emplantas pode representar uma alternativa atrativa, segura e barata ao sistemaconvencional. Antígenos, como HBsAg de organismos infecciosos como o vírus dahepatite-B podem ser produzidos em plantas transformadas. Um sistema deexpressão que usa plantas como biorreator requer elevadas taxas de regeneraçãoe transformação. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um eficienteprotocolo de regeneração e transformação visando estabelecer um sistema deexpressão para a produção do antígeno de HBsAg. Para isso, foram realizadosexperimentos para avaliar os fatores que influenciam o processo de regeneração,seleção, assim como, determinar parâmetros de transformação, viaAgrobacterium, usando segmentos de folhas e entrenós de Nicotiana tabacum L.cv. SR1. Para regeneração a concentração de cinetina ideal foi de 1,0 mg.L -1 e 2,0mg.L -1 para entrenós e segmentos de folha, respectivamente. O teste de tolerânciaa canamicina mostrou ser altamente eficiente, obtendo-se a supressão daregeneração com 50 mg.L -1 e 100 mg.L -1 para segmentos de folhas e entrenós,respectivamente. Apesar do bom desempenho de regeneração dos explantes defolhas nos testes de regeneração, para a transformação via Agrobacterium,entrenós foram significativamente mais eficientes. Além disso, para tabaco cv.SR1 os parâmetros ideais foram o pré-condicionamento por 4 dias em meio deregeneração, os explantes foram colocacados por 10 min em Agrobacterium emmeio MS, um co-cultivo de 24 h em meio semi-sólido, a lavagem dos explantescom os antibióticos cefotaxima (100 mg.L -1 ) e tetraciclina (400 mg.L -1 ), sendo essaa combinação de antibióticas menos tóxica. A regeneração, após a transformaçãodeve ser feita sem a presença de canamicina, já que esta inibe a regeneração degemas. A otimização dos parâmetros de transformação resultou em percentagensde transformação significativamente maiores. Os explantes, calos e primórdiosmeristemáticos eram quimeras para a atividade da ? -glucoronidase, onde seobservou explantes sem atividade e outros com forte atividade. Porém, não foipossível confirmar que as plantas transformadas possuíam o T-DNA integrado aogenoma de forma estável, e recomendam-se análises moleculares adicionais paraverificar a presença do gene hbsag nas plantas bem como verificar a viabilidadeda cepa C58C1 da Agrobacterium para a transformação efetiva de plantas. Osucesso demonstrado para a regeneração e transformação representam umimportante avanço estratégico para o uso de plantas como biorreator visando aexpressão recombinante do antígeno de HBsAg.
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Bibliographical Information:

Advisor:Pedro Canisio Binsfeld

School:Universidade Federal de Pelotas

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:biotecnologia tabaco nicotiana tabacum proteínas recombinantes proteinas

ISBN:

Date of Publication:06/27/2005

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