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Produção, purificação, caracterização e estudo da aplicação de uma protease alcalina produzida por Cellulosimicrobium cellulans 191.

by dos Santos, Luciana Ferracini

Abstract (Summary)
Cellulosimicrobium cellulans 191 é um microrganismo produtor de um complexo enzimático capaz de degradar a parede celular de leveduras, composto de enzimas b-1,3-glucanases, proteases e quitinases. Este microrganismo adere à célula de levedura e provoca sua lise. C. cellulans 191 foi isolado de resíduos de indústria de fermentação alcoólica. Células desidratadas de Saccharomyces cerevisiae foram usadas no meio de cultura como indutor para a produção da protease. O meio de cultura inicial era composto por 1% de células de S. cerevisiae desidratadas; 13,6 g/L de KH2PO4; 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 4,2 g/L de KOH; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O; 0,001 g/L de Fe2(SO4)3.6H2O; 1 mg/L de biotina e 1mg/L de tiamina. Realizou-se um planejamento experimental fracionário 28-3 cujas variáveis independentes foram os componentes do meio de cultura inicial, este planejamento mostrou que os componentes KH2PO4, KOH e o indutor apresentaram efeito estatisticamente significativo na atividade de protease do meio de cultura. Um planejamento experimental 22 foi realizado usando-se dois fatores, pH e porcentagem de células desidratadas de levedura. Os resultados mostraram que o meio de cultura para a máxima produção de protease seria composto por 8% de células desidratadas de levedura; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 2,0 g/L de (NH4)2SO4 em solução tampão fosfato 0,15 M e pH 8,0. A maior produção de protease foi obtida quando a fermentação ocorreu em temperaturas entre 20 e 27 ºC, após 24 horas de fermentação. A produção da protease foi aumentada cerca de 36 vezes após a otimização do meio de cultura e das condições de fermentação. Para a produção de protease, a linhagem de Cellulosimicrobium cellulans 191 foi fermentada no meio de cultura otimizado em frascos agitados a 27ºC durante 24 horas a 150 rpm. Para a extração da protease extracelular, o sobrenadante do meio de cultivo foi saturado com 40% de sulfato de amônio. O precipitado foi coletado por centrifugação e ao sobrenadante foi adicionado sulfato de amônio até 80% de saturação. O precipitado contendo a protease foi coletado por centrifugação, dialisado e purificado por cromatografia em colunas de DEAE-Sepharose e Q-Sepharose. O fator de purificação obtido foi de 16,8 e o rendimento foi 7,8%. A massa molecular da protease purificada foi estimada em 55 KDa por cromatografia em gel de filtração Sephacryl S-200. A protease apresentou temperatura e pH ótimos de 7,0 a 8,0 e de 50 a 64ºC, respectivamente. A protease foi estável em uma faixa de pH de 4,0 a 7,5 após uma hora a 83ºC quando estabilizada por DTT. Os valores de Km e Vmáx da protease foram 0,027 mg de caseína /mL e Vmáx. de 6,25 U/mg de enzima, respectivamente. A protease purificada foi ativada por 1 mM de FeCl3 e parcialmente inibida por fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSP). A protease purificada foi capaz de lisar células viáveis de Saccharomyces cerevisiae. A aplicação desta protease no isolamento de componentes da parede celular de levedura foi estudada. A glucana é o principal componente da parede celular de Saccharomyces cerevisiae. Nos processos convencionais para o isolamento desse polissacarídeo, são usadas condições de pH extremas que provocam sua degradação. Um método que combina tratamento físico e enzimático utilizando a protease alcalina de Cellulosimicrobium cellulans 191 foi proposto. A glucana foi obtida com pureza de 87,4% e rendimento de 33,7%. Durante este processo, foi facilmente obtida a manana-proteína da parede celular de levedura.
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Bibliographical Information:

Advisor:Helia Harumi Sato; Helia Harumi Sato [Orientador]; Ranulfo Monte Alegre; Margarida Massami Yamaguchi; Maria Gabriela Bello Koblitz; Severino Matias de Alencar; Glaucia Maria Pastore; Francisco Maugeri Filho

School:Universidade Estadual de Campinas

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:protease enzimas glucanas proteases enzymes

ISBN:

Date of Publication:

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