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Identificação e caracterização de proteinas que se associam 'in vitro' a fita telomerica rica em G de 'Leishmania (Leishmania) amazonensis'

by Fernandez, Maribel Fernandez

Abstract (Summary)
Os terminais dos cromossomos de Leishmania (Leishmania) amazonensis contêmrepetições teloméricas mantidas pela enzima telomerase da seqüência 5'-TTAGGG-3', a qual é conservada também em outros tripanosomatídeos e outros eucariotos. Utilizando-se frações protéicas purificadas a partir de extratos S100 e nuclear, foi possível se detectar atividade de telomerase e três complexos proteína-DNA que se associam in vitro com seqüências teloméricas ricas em G do parasita. A atividade de telomerase de L. (L.) amazonensis foi detectada por ensaio TRAP ("Telomeric Repeat Amplification Protocol") e apresenta características comuns às telomerases já descritas em outros tripanosomatídeos.Os complexos proteína-DNA foram identificados por EMSA ("Electrophoretic MobilityShift Assays") e ensaios de "UV cross-linking" e denominados LaGT1-3 (Leishmaniaamazonensis G-strand telomeric protein 1-3). Eles não são formados: i) com DNA telomérico na forma de dupla fita e com fita rica em C, ii) em experimentos de competição específica usando oligonucleotídeos de seqüências de DNA telomérico, ou iii) após o tratamento enzimático com proteinase K. LaGT1 foi o complexo mais específico, o qual é formado com todas as seqüências de DNA telomérico (Tel1-6, Tel30 e Tel36) e não se associa à seqüência telomérica de Tetrahymena. As proteínas que formam os três complexos associam-se com uma seqüência de RNA telomérico rica em G e um complexo similar a LaGT1 é formado com DNA telomérico na forma de dupla fita contendo uma projeção 3' simples fita terminal. A estimativa das constantes de dissociação (Kd) do complexo LaGT1 associado a seqüência telomérica na forma de DNA e dos complexos LaGT2 e LaGT3 associados a seqüências teloméricas na forma de DNA ou RNA,demonstra que estes se encontram na ordem de nM, característica comum a proteínas que ligam DNA na forma de simples fita. Os componentes protéicos dos complexos LaGT2 e LaGT3 foram purificados por cromatografia de afinidade e identificados após renaturação, como bandas de ~35 kDa e ~52 kDa, respectivamente. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 foi purificado em gel como um complexo irradiado com luz UV de ~18-20 kDa. Os componentes protéicos de LaGT2 e LaGT3 e o complexo irradiado LaGT1 foram digeridos em gel com tripsina e os peptídeos trípticos resultantes foram analisados por espectrometria de massa utilizando-se as técnicas: "Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight" (MALDI-TOF) e "Liquid Chromatography Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry" (LC/ESIMS/MS), a análise dos espectros demonstrou que o componente protéico de ~35 kDa de LaGT2 é homólogo da proteína Rbp38 de Leishmania spp. enquanto, o componente protéico de ~52 kDade LaGT3 é similar à subunidade 1 da proteína de replicação A (Rpa-1) de Leishmania spp. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 provavelmente uma proteína de L. (L.) amazonensis que ainda não foi identificada. A identificação das proteínas por espectrometria de massa, possibilitou a clonagem dos genes que codificam às mesmas. Neste trabalho apresentamos a caracterização parcial do gene que codifica o componente protéico do complexo LaGT3: subunidade 1 da proteína de replicação A de L. (L.) amazonensis (LaRpa-1). A análise da sua organização genômica demonstrou que o mesmo encontra-se provavelmente em baixo número de cópias ou em cópia única no genoma do parasita e que ele se localiza em uma banda cromossômica de ~0,8 Mb. Foi realizada também a análise conformacional parcial da interação entre a proteína nativa renaturada LaRpa-1 e o DNA telomérico rico em G de L. (L.) amazonensis (oligonucleotídeo Tel6) por espectroscopia de fluorescência mostrando-se um aumento da intensidade da fluorescência quando ocorre essa interação
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Bibliographical Information:

Advisor:Maria Isabel Nogueira Cano; Maria Isabel Nogueira Cano [Orientador]; Nilson Ivo Tonin Zanchin; Irene da Silva Soares; Jose Franco da Silveira Filho

School:Universidade Estadual de Campinas

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:telomeros leishmania amazonensis cromatina telomeres chromatin

ISBN:

Date of Publication:10/15/2004

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