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Produção e purificação de penicilina G acilase. Production and purification of penicillin G Acylase.

by Pinotti, Laura Marina

Abstract (Summary)
Este trabalho teve como objetivo principal estudar o processo de produçãoe purificação de PGA de B. megaterium. A produção foi estudada em frascosagitados e/ou fermentador, abordando-se os seguintes aspectos: estudo da purezada cultura, padronização e conservação do inóculo, otimização do tempo total decultivo (germinação/propagação e produção), volume do inóculo, requerimentosnutricionais do B. megaterium para a produção da enzima, pH, concentração deoxigênio dissolvido e modo de alimentação. A partir desses ensaios concluiu-seque a conservação do microrganismo em criotubos, na presença de glicerol,mostrou ser eficiente. Tempo de germinação de 11 horas e 24 horas na etapa deprodução são os suficientes para atingir máxima produção da enzima. Quanto aovolume de inóculo, 3 mL de inóculo/75 mL de meio (108 esporos/mL de inóculo),em frascos de 500 mL, foram as condições ótimas encontradas para produçãodeste. Diferentes fontes de carbono e nitrogênio foram estudadas e verificou-seque glicose, glicerol e concentrações de aminoácidos acima de 10,0 g/L reprimema síntese da enzima e que a maior produção de PGA por B. megaterium ocorrequando o microrganismo cresce consumindo aminoácidos livres, ácido fenilacético (indutor), na presença de algum fator presente no soro de queijo. Osdiferentes componentes do soro de queijo foram investigados e verificou-se quenenhum dos macronutrientes é o responsável pelo significativo efeito do soro naprodução da enzima. Este trabalho permitiu o aumento das atividades enzimáticasde 56 UI/L e 8,6 UI/g célula, obtidas no primeiro ensaio realizado com o inóculopadronizado, para 220 UI/L e 65 UI/g célula com as seguintes condições: 10 g/Lde aminoácidos, 19,6 g/L de soro de queijo, 0,4 g/L de sais, 2,7 g/L de ácido fenilacético (AFA), pH inicial 8,0, ausência de controle de pH, adição de AFA noinício do cultivo e controle de oxigênio dissolvido próximo de 20% da saturação.Foi também realizado, durante estágio em Portugal, estudo de produção dePGA por Escherichia coli, visando estudo posterior da técnica de adsorção emleito expandido e comparação das condições de produção da enzima por E. colicom as utilizadas para B. megaterium. A máxima produção de enzima obtida foide 400 UI/L. As mesmas condições operacionais utilizadas para E. coli foramtestadas para B. megaterium e não resultaram na produção de enzima. No estudo da concentração e purificação da enzima produzida por B.megaterium foi otimizada a técnica de precipitação com etanol, cujo estudo seiniciou em trabalho prévio, e estudadas as técnicas de ultrafiltração e adsorção emleito expandido (A.L.E). A ultrafiltração conseguiu concentrar a enzima atéatividade final 1541UI/L. A temperatura mostrou ser uma variável importante,conseguindo-se evitar inativação térmica da enzima concentrada realizando-se atécnica a 4ºC. No processo de precipitação com etanol, os melhores resultadosforam obtidos com vazão de 0,03 mL/s para os 22 mL iniciais de etanol e de 0,25mL/s para os 98 mL de etanol restantes, com ajuste do pH do caldo para 6, sem arealização prévia de diálise. Na aplicação da adsorção em leito expandido acapacidade de ligação dinâmica encontrada para a PGA em caldo clarificado foipróxima de 5 UI/ mL de gel, com recuperação global de 30 % da enzima inicial.Valor similar para a capacidade de ligação dinâmica foi encontrado para PGA deE. coli.
Bibliographical Information:

Advisor:Raquel de Lima Camargo Giordano

School:Universidade Federal de São Carlos

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:engenharia quimica tecnologia de enzimas penicilli g acilase fermentação penicillina purificação bacillus megaterium escherichia coli

ISBN:

Date of Publication:06/26/2003

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