Details

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

by Badosa Romañó, Esther

Abstract (Summary)
Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). Shan descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. Lobjectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques dun grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat destablir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat dactuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, lobjectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores daquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu sha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. Shan realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant lús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en lús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, denriquiments daquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total shan aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. Sha constituït una collecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de colleccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents dun treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la collecció shi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques shan caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica sha portat a terme mitjançant la identificació a nivell despècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant lús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); leficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores dIAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en lantagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií lantagonisme. En el cas dels fongs no sha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques sha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 daquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs dinhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, shan observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en lhíbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica sha realitzat mitjançant lanàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i lanàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no sha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat dactuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol shan caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. Sha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En lanàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD sha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no shan pogut relacionar amb lorigen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica sha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions dSpearman i de freqüències amb variables categòriques). Sha demostrat la importància de disposar duna tècnica que permeti depurar una collecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no sha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.
This document abstract is also available in English.
Bibliographical Information:

Advisor:Montesinos Seguí, Emili

School:Universitat de Girona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:eqata enginyeria química agrària i tecnologia agroalimentària

ISBN:

Date of Publication:12/21/2001

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.