Details

Identificació de nous gens a la regió cromosòmica 21q22. Caracterització molecular de KCNE2 i KCNE3.

by Domenech Gimeno, Anna

Abstract (Summary)
El cromosoma humà 21 (HSA21), és el cromosoma autosòmic humà més petit. La trisomia total o parcial del HSA21 està associada a síndrome de Down (SD). El fet de tenir la seqüència del HSA21 pràcticament complerta, ha accelerat molt el procés d'identificació de gens, pas previ per a l establiment de relacions causa-efecte entre els gens del HSA21 i els fenotips clínics de la SD. L'objectiu final d'aquesta tesi és la identificació i caracterització de nous gens del HSA21. Els resultats obtinguts es poden resumir en : Sha participat en la construcció dun contig de cosmidis de tres regions del HSA21, cobrint al voltant de 3 Mb. S ha participat en la construcció dun mapa transcripcional de les tres regions. Es va realitzar una selecció de cDNAs, aïllant en total 45 cDNAs parcials no redundants, dels quals 25 no mostraven similitud amb cap seqüència de les bases de dades. Tots sexpressaven en una barreja de RNA poliA+ de cervell, pulmó, fetge i ronyó fetals. Els intents daïllar els cDNAs complerts corresponents a cada un dels clons varen resultar negatius. S ha aïllat un nou gen del HSA21, KCNE2, identificat inicialmente mitjançant una anàlisi computacional de la seqüència genòmica AP000052. El cDNA complert té 850 pb. KCNE2 codifica per a una proteïna de 123 aa amb elevada homologia a KCNE1, una subunitat ß de canals de potassi depenents de voltage. L'estructura genòmica té un únic exó codificant i mapa a 21q22.1. KCNE2 s'expressa com un RNA de 1.2 kb, majoritàriament a estómac. La seqüència de la proteína KCNE2 conté 2 llocs consens de N-glicosilació, es prediu una regió transmembrana i un lloc consens de fosforilació per PKC. En experiments de western amb extractes de cèllules de mamífer transfectades, la proteïna es detecta com a tres bandes entre 16 kDa i 20 kDa, essent la més petita la del pes molecular esperat. Experiments amb tunicamicina han demostrat que KCNE2 es glicosila en asparagines, in vivo. Es van generar dos mutants en els llocs consens de glicosilació, N6Q i N29Q, que han demostrat que ambdós llocs són susceptibles de ser glicosilats. Experiments dimmunofluorescència indirecta suggereixen que KCNE2 sinserta en la membrana amb el seu extrem N-terminal cap al medi extracellular i que amb un únic residu glicosilat nhi ha prou per integrar-shi. Experiments de RT-PCR semiquantitativa indiquen que no hi ha sobre-expressió en SD ni de KCNE1 ni de KCNE2, a cors fetals SD. Es van buscar mutacions a KCNE2 en pacients de sordesa no sindròmica i es va trobar un canvi de nucleòtid A22G, que dóna lloc a un canvi d'aminoàcid T8A. Aquest canvi afectaria el punt de glicosilació. Es va identificar un nou gen, por homologia a KCNE1 i KCNE2, al qual se li va donar el nom de KCNE3. El cDNA complert té 1646 pb i conté una pauta de lectura oberta de 103 aa. Lestructura genòmica és similar a la de KCNE1 i KCNE2, amb un únic exó codificant, per tant podria tractar-se duna família de gens paràlegs. KCNE3 es va mapar a la regió 11q13-14, utilitzant el pannell d'híbrids de radiació G3 d'Stanford. KCNE3 sexpresa com a un mRNA de 3 Kb a colon, intestí prim, ovari i a sang perifèrica. La seqüència de aminoácidos conté 3 llocs consens de N-glicosilació, es prediu una regió transmembrana i un lloc consens de fosforilació per PKC. S ha demostrat que KCNE3 es N-glicosila en cèllules de mamífer i que sinserta a la membrana amb l'extrem N-terminal dirigit cap al medi extracellular. Sha trobat un polimorfisme T198C, que provoca el canvi d'aminoàcid F66L, amb una freqüència del 15% en la población general.
Bibliographical Information:

Advisor:Pritchard, Melanie A.; Luna Gargantilla, Susana de la; Estivill Pallejà, Xavier

School:Universitat de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:biologia cel·lular i anatomia patològica

ISBN:

Date of Publication:12/12/2001

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.