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Construção de marcador auxotrófico em Mycobacteriumbovis BCG, de uma cepa knockout para DPPD e estudoproteômico da tuberculina

by Borsuk, Sibele

Abstract (Summary)
Mycobacterium bovis BCG tem o potencial para ser um vetor efetivo paravacinas recombinantes multivalentes. No entanto, existem dois problemasquanto a sua utilização como vetor vacinal. O primeiro é a presença de genesque conferem resistência a antibióticos nos vetores utilizados paratransformação genética. O segundo é a limitação de uso de BCG em animais,principalmente por comprometer o teste de tuberculina, utilizado comodiagnóstico de tuberculose, o qual se baseia em reação de hipersensibilidadeao PPD (Derivado Protéico Purificado). Neste trabalho desenvolvemos eavaliamos a complementação auxotrófica como novo marcador de seleção,fizemos a caracterização das proteínas componentes de amostras de PPDaviário e bovino e desenvolvemos um mutante de BCG por recombinaçãohomóloga. Para o uso de complementação auxotrófica como marcador deseleção, uma cepa de BCG auxotrófica para o aminoácido leucina foiconstruída por knockout do gene leuD por recombinação homóloga. Aexpressão do gene leuD em um plasmídio atuou como marcador de seleçãonas cepas auxotróficas de M. bovis BCG amp;#61508;leuD e M. smegmatis mc2144. Aseleção por complementação de BCG auxotrófica se mostrou equivalente àseleção por resistência a antibiótico, com a vantagem adicional de proporcionarmaior estabilidade do vetor plasmidial, já que a pressão seletiva é mantidamesmo durante multiplicação da bactéria in vivo. A identificação das proteínasque compõem o PPD foi feita por espectrometria de massa utilizando-se LCMS/MS (cromatografia líquida associada à espectrometria de massa emtandem). Foram identificadas 147 proteínas entre 5 amostras de PPD (2 PPDbovino e 3 PPD aviário). O PPD bovino teve um número maior de proteínascomparado ao PPD aviário. Foi identificado um grupo de 28 proteínaspresentes em PPD bovino, mas ausentes em PPD aviário. Além disso, 5proteínas encontradas no PPD estão ausentes em M. bovis BCG. Estes são de9especial interesse, pois poderão vir a contribuir para o desenvolvimento de umteste de diagnóstico mais específico, e possivelmente capaz de diferenciarindivíduo vacinado com BCG e infectado com o bacilo da tuberculose. Ummutante de M. bovis BCG Pasteur foi construído. O gene Mb0092 (dppd) foialvo de inativação gênica por recombinação homóloga. Seqüências queflanqueiam o gene alvo foram clonadas em um vetor suicida. Duplo crossoverfoi selecionado utilizando sacB. O genótipo mutante foi determinado por PCR epor Southern blot. Esta cepa poderá ser utilizada como vacina em animais,quando o diagnóstico for feito com DPPD recombinante. Os resultados obtidosapresentam alternativas para os problemas envolvidos quanto à utilização deM. bovis BCG como vacina recombinante. O sistema de seleção porcomplementação auxotrófica foi estável, e pode ser empregado na expressãode antígenos heterólogos em BCG. A identificação dos principais componentesprotéicos do PPD e o desenvolvimento da cepa mutante de BCG possibilitam odesenvolvimento de testes diagnósticos diferencias, permitindo a utilização deBCG como vacina também em animas.
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Bibliographical Information:

Advisor:Odir Antônio Dellagostin; Fabrício Rochedo Conceição

School:Universidade Federal de Pelotas

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:complementação auxotrófica caracterização PPD IMUNOLOGIA

ISBN:

Date of Publication:02/28/2008

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