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Caracterização de ligantes de heparina em Trypanosoma cruzi e determinação do domínio de heparam sulfato envolvido no processo de invasão T. cruzi-cardiomiócito in vitro.

by Rodrigues de, Francisco Odencio

Abstract (Summary)
A capacidade do Trypanosoma cruzi de reconhecer moléculas na superfície de células fagociticas e não-fagociticas profissionais é essencial para sua sobrevivência nohospedeiro vertebrado. O papel de proteoglicanos sulfatados no processo de reconhecimento celular tem sido relatado em muitos patógenos humanos, incluindo o T. cruzi. Dados do nosso grupo demonstraram a participação de proteoglicanos de heparam sulfato (PGHS) de cardiomiócitos na invasão por formas tripomastigotas. Entretanto, a estrutura da molécula de PGHS envolvida na interação receptor-ligante e o papel de outros glicosaminoglicanos (GAGs) sulfatados no processo de invasão ainda não foram elucidados. Para avaliar a participação dos GAGs na invasão do T. cruzi, tripomastigotas, clone Dm28c, foram pré-tratados com 20amp;#956;g/ml de heparina, queratam sulfato (KS) ou trêsfragmentos distintos de heparam sulfato (HS), os quais foram obtidos por tratamento enzimático (heparitinase I e II) e ácido nitroso. Nos ensaios de competição, os parasitascontroles ou pré-tratados com GAGs solúveis foram incubados por 2hs a 37°C com culturas de cardiomiócitos e o percentual de infecção foi determinado após coloração pelo Giemsa.Nossos resultados revelaram uma inibição significante no índice de infecção de 84,8% e 45% após tratamento dos parasitas com heparina e com o fragmento N-acetilado/Nsulfatado (NA/NS), respectivamente, sugerindo o importante papel do domínio ([IdoUAGlcNAc]-[GlcUA-GlcNS]3-[GlcUA-GlcNAc]4[GlcNAc]), da cadeia de HS no reconhecimento T. cruzi-cardiomiócito. Em contraste, o tratamento dos parasitas com KS, fragmento Nacetiladoou N-sulfatado não apresentou efeito no processo de invasão. O papel da sulfatação no processo de reconhecimento e invasão foi avaliado pelo tratamento de culturas de cardiomiócitos por 16hs a 37°C com dife rentes concentrações de clorato de sódio e posteriormente, infectados com tripomastigotas (2hs). O declínio da sulfataçãoresultou na redução (dose dependente) do índice de infecção, alcançando níveis de inibição de 26%, 48,5% e 73,6% após o tratamento de cardiomiócitos com 25 mM, 50 mM e 75 mMde clorato de sódio, respectivamente, sugerindo a participação da carga negativa como moduladora do reconhecimento específico com o domínio NA/NS da cadeia de HS. Adicionalmente, ensaios bioquímicos foram realizados para caracterizar a proteína de ligação a heparina presente na superfície do T. cruzi. Duas bandas majoritárias de 65,8kDa e 59 kDa foram identificadas no extrato protéico total das 3 formas evolutivas do T. cruzi por Western blotting, utilizando heparina, condroitim sulfato (CS) e HS conjugados a biotina. O ligante de heparina de T. cruzi foi isolado pela associação do método do Triton X-114 e cromatografia de afinidade a heparina-Sepharose. Após marcação metabólica (35SMetionina), as proteínas hidrofóbicas foram isoladas em coluna de afinidade e separadas por SDS-PAGE, revelando um perfil protéico, similar ao extrato total, com duas bandasmajoritárias (65,8 kDa e 59 kDa) eluídas com 0,5 M e 1,0 M de NaCl em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. A análise isotópica também revelou uma expressãosuperior deste ligante (1,3-2 vezes) em tripomastigotas quando comparado com epimastigotas. As proteínas de ligação a heparina (65,8 kDa e 59 kDa) foram detectadas nafração de membrana de epimastigotas obtida pelo método de fracionamento subcelular associado a purificação em coluna de afinidade. A detecção das proteínas eluídas da colunade afinidade a heparina por Western blotting com heparina-, HS- e CS-biotinilados revelou intensa marcação principalmente na proteína de 59 kDa. Além disso, a análise das proteínas por eletroforese não desnaturante revelou a presença de duas bandas nas formas tripomastigotas e epimastigotas de T. cruzi. Ensaios bioquímicos complementares serão realizados a fim de obter informações detalhadas sobre a proteína de ligação a heparina de T. cruzi.
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Bibliographical Information:

Advisor:Maria de Nazareth Silveira Leal de Meirelles; Mirian Claudia de Souza Pereira

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Doença de Chagas Miócitos Cardíacos BIOLOGIA GERAL

ISBN:

Date of Publication:04/09/2007

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