Details

Identificació immunològica i caracterització de les propietats biològiques de la proteïna catiònica deosinòfil

by Carreras Margalef, Ester

Abstract (Summary)
La proteïna catiònica deosinòfil (ECP) és una ribonucleasa que es troba als grànuls secundaris dels eosinòfils. Els nivells dECP en fluids corporals sutilitza com a indicador del número i activació dels eosinòfils. LECP és tòxica per diversos patògens com són bacteris, paràsits, virus i per cèl·lules de mamífer. Per identificar immunològicament lECP sha seleccionat una regió específica de la proteïna (D112-P123) com a possible epítop antigènic. La regió D112-P123 no es troba en lRNasa A, 1, 4 i 5 i és on sobserva una màxima desviació de lesquelet de la cadena principal de lECP i la neurotoxina derivada deosinòfil (EDN) amb la qual comparteix un 67% didentitat de seqüència. Shan immunitzat conills amb un pèptid sintètic (D112-P123) conjugat a una proteïna transportadora i shan purificat els anticossos policlonals amb una columna dafinitat amb lECP immobilitzada. Lanticòs D112-P123 reconeix específicament lECP en condicions reductores i no reductores i no presenta reactivitat creuada amb lEDN, lRNasa A i altres proteïnes control. La immunodetecció per transferència Western amb lanticòs D112-P123 ha mostrat que hi ha una relació lineal entre la quantitat de proteïna (1-75 ng) i el senyal obtingut. Sha assajat la reactivitat de lanticòs D112-P123 en fluids corporals i granulòcits. Lanticòs D112-P123 detecta la forma nadiua no glicosilada i les formes glicosilades de lECP en granulòcits, esput i plasma. Sha obtingut una bona correlació entre els nivells dECP determinants amb lanticòs D112-P123 i amb un anticòs que comercialitza Pharmacia & Upjohn (Uppsala, Suècia). Per estudiar la relació entre lestructura i les activitats biològiques de lECP shan obtingut variants de la proteïna en residus específics de lECP. Shan escollit residus catiònics i aromàtics exposats en la superfície de la proteïna (W10K, W35A/R36A, R75A/F76A, R101A/R104A) i de la regió del loop D115-Y122 (R121A, R121A/Y122A, (_ 115-122) ECP i (115-122 EDN) ECP . Sha estudiat lefecte de lECP i les seves variants en lactivitat ribonucleasa, la disrupció de membranes, la citotoxicitat per bacteris gramnegatius i grampositius i linhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. També sha realitzat una predicció de lestructura tridimensional dels mutants per modelatge molecular. Les variants de lECP no modifiquen substancialment ni lestructura tridimensional de la proteïna ni lactivitat ribonucleasa. Lactivitat sobre membranes de lECP i les seves variants sha analitzat utilitzant vesícules sintètiques. LECP mostra una clara preferència per desestabilitzar vesícules acídiques resultat que suggereix que les càrregues positives de la proteïna són importants per la interacció amb les membranes. Lestudi de lefecte de les mutacions en lactivitat sobre les membranes ha mostrat que aminoàcids catiònics específics i els triptòfans de la proteïna (W10, W35R36 i R101R104) estan relacionats amb la desestabilitazació de la membrana. Aquests resultats correlacionen bé amb lefecte dels mutants en la inhibició del creixement de cèl·lules de mamífer. Les regions W35R36 i W10 són essencials per la inhibició de la proliferació. Altres residus catiònics i aromàtics R75F76, R101R104, Y122 tenen un paper secundari en linhibició del creixement que es pot explicar per la possible interacció daquests residus amb els carbohidrats de la superfície de les cèl·lules de mamífer. La regió W35R36 té un paper essencial en lactivitat bactericida per grampositius i gramnegatius. Els altres residus estudiats tenen efectes diferents en lactivitat bactericida de lECP depenent es tracti d E. coli o S. aureus. Mentre els residus R101R104 i R75F76 són importants per lactivitat bactericida sobre E. coli, els residus W10 i la regió del bucle D115-Y122 són necessaris per lactivitat bactericida sobre S. aureus. Podem concloure que les regions catiòniques i hidrofòbiques estudiades participen en la capacitat de lECP per desestabilitzar membranes biològiques i/o en la interacció de la proteïna amb components de la paret bacteriana o amb els carbohidrats de la superfície de cèl·lules de mamífer.
This document abstract is also available in English.
Bibliographical Information:

Advisor:Noguès Bara, M. Victòria; Boix Borràs, Ester

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:03/07/2004

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.