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Introducción de la tecnología de transferencia génica en lubina (Dicentrarchus labrax)

by Muñoz Forcada, Iciar

Abstract (Summary)
RESUMEN Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferencia génica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudio y evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a la transgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistema de regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último, se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema de expresión de genes exógenos. Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficiente para transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen la expresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estado metabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria, alcanzándose el máximo cinco días después de la inyección. Una limitación de esta técnica es la incapacidad de reproducir en los distintos individuos inyectados, la manera exacta en que la aguja de inyección entra en el paquete muscular, lo que origina una gran variabilidad en cuanto a la toma de DNA por parte de las células, y por tanto en el nivel de expresión del transgen. Esto se puede mejorar aumentando el número de animales inyectados para disminuir así el error debido a la técnica, o usando una segunda construcción para normalizar la transfección. La técnica de inyección de DNA en músculo se ha ensayado como método de vacunación en peces. Sin embargo, ésta es la primera vez, que se prueba esta técnica en peces para secretar una hormona en sangre. Como gen a inyectar se ha diseñado y construido un gen híbrido que codifica una hormona gonadotropa de cadena única de lubina. Tras su inyección en músculo de lubina se pudo detectar la proteína en plasma. Para sistemas de origen piscícola, no se dispone hasta el momento de un método que permita controlar la expresión de genes exógenos de manera fiable. Por primera vez, hemos probado la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina para esta misión. Tras valorar diferentes versiones del sistema en células de pez in vitro y en músculo in vivo, podemos concluir que la opción más eficiente es el uso del transactivador tTA bajo el control de un promotor estable. Al igual que en células de mamíferos, hemos comprobado que las células de pez también presentan dificultades para mantener el sistema de regulación por tetraciclina de una manera funcional; como resultado, encontrar clones con un grado de regulación óptimo y un nivel bajo de expresión basal es difícil. Sin embargo, el uso de una estrategia basada en el uso del plásmido nuevo pTet-luc+-pur/GFP facilita esta tarea, y permite obtener un alto porcentaje de clones regulables. A lo largo de este trabajo se han comparado los promotores CMV, de origen viral, y el promotor de la actina ß de carpa, para dirigir la expresión de distintos genes tanto en las líneas celulares EPC y SBL, como en músculo de lubina in vivo. Los resultados nos permite concluir que el promotor de la actina ß de carpa, es más débil en cuanto al nivel de expresión génica que logra promover, y menos estable a la hora de mantenerse en una línea celular que el promotor CMV. Por último, los resultados obtenidos con la línea celular SBL permiten señalar a esta línea como un sistema de lubina apto para la expresión de genes exógenos. Estas células son capaces de secretar los productos de los genes introducidos, con lo que podrían ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes. __________________________________________________________________________________________________ABSTRACT This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass. On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to the use of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used as method of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in sea bass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system to control exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the use of the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell line has proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene.
Bibliographical Information:

Advisor:Carrillo Estévez, Manuel; Gómez Peris, Ana

School:Universitat de València

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:fisiologia

ISBN:

Date of Publication:11/07/2005

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