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Caracterització cinètica de la formació de fibres amiloides i cerca de funcions remotes de dominis d'activació de procarboxipeptidases humanes

by Cerdà Costa, Núria

Abstract (Summary)
Els dominis dactivació són presents en la porció N-terminal de la forma inactiva de les procarboxipeptidases de la subfamília de proteases M14A, i les seves funcions descrites comprenen tant el manteniment daquest estat inactiu com lassistència en el plegament de lenzim complet. La limitada mida i la notable estabilitat derivada de la gran quantitat destructura secundària han fet que un daquests dominis, el de la procarboxipeptidasa A2 humana (ADA2h) hagi estat un bon model per a lestudi del plegament proteic, en treballs anteriors, i de lagregació en forma de fibres amiloides en la present tesi. Els estudis cinètics de dicroisme circular de la variant salvatge i una extensa bateria de mutants puntuals revelen la seqüència corresponent a la cadena beta-4 com la responsable de la direcció del procés dagregació ordenada en conformació beta. Mutacions en aquesta zona tenen la capacitat tant daccelerar dramàticament la velocitat dagregació, com dabolir-la totalment. Les correlacions amb algorismes predictius de lagregació basats en les propietats físico-químiques de la seqüència polipeptídica posen de manifest la rellevància principal de lestructura primària en el govern del procés. La cinètica dagregació per dicroisme circular mostra una naturalesa dual, amb una segona etapa pràcticament independent de concentració proteica, indicant una etapa tardana de reorganització conformacional. Estudis cinètics complementaris per espectroscòpia dinfraroig mostren igualment una reorganització molecular i assenyalen que la conformació agregada en beta present a la fibra amiloide sembla originar-se primerament a partir de les hèlixs-alfa parcialment desplegades. Lestudi de mutants amb diferent propensió a lagregació i estabilitat ha mostrat que les mutacions comporten canvis en la via dagregació, però que finalment arriben al mateix punt de fibril·lació. Una possible funció alternativa per a un daquests dominis, els quals tenen una extraordinària complexitat en comparació amb altres seqüències inhibidores en cis, ha estat cercada mitjançant eines bioinformàtiques. Certa similitud seqüencial i estructural sembla ser trobada entre el domini dactivació de la procarboxipeptidasa A4 humana (ADA4h) i un domini dunió a RNA (RRM), suggerint una possible funció ancestral per al primer, bé que no tots els residus claus per a la interacció són presents a ADA4h. La hipòtesi ha estat comprovada experimentalment mitjançant un gel de retardament, observant-se una unió a RNA dèbil i inespecífica per al RNA assajat, dacord amb el que shavia predit bioinformàticament. Aquest fet no exclou, emperò, una unió fisiològica i específica amb un altra molècula de RNA diferent a lassajada. Los dominios de activación están presentes en la porción N-terminal de la forma inactiva de las procarboxipeptidasas de la subfamilia de proteasas M14A, y sus funciones descritas comprenden tanto el mantenimiento de este estado inactivo como la asistencia en el plegamiento de la enzima completa. Su limitada longitud y notable estabilidad, derivada de la gran cantidad de estructura secundaria, han hecho que uno de estos dominios, el de la procarboxipeptidasa A2 humana (ADA2h) haya sido un buen modelo para el estudio del plegamiento proteico, en trabajos anteriores, y de la agregación en forma de fibras amiloides en la presente tesis. Los estudios cinéticos de dicroísmo circular de la variante salvaje y una extensa batería de mutantes puntuales revelan la secuencia correspondiente a la cadena beta-4 como la responsable de la dirección del proceso de agregación ordenada en conformación beta. Mutaciones en esta zona tienen la capacidad tanto de acelerar dramáticamente la velocidad de agregación, como de abolirla totalmente. Las correlaciones con algoritmos predictivos de agregación basados en las propiedades fisicoquímicas de la secuencia polipeptídica ponen de manifiesto la relevancia principal de la estructura primaria en el gobierno del proceso. La cinética de agregación por dicroísmo circular muestra una naturaleza dual, con una segunda etapa prácticamente independiente de concentración proteica, indicando una etapa tardía de reorganización conformacional. Estudios cinéticos complementarios por espectroscopia de infrarrojo muestran igualmente una reorganización molecular y señalan que la conformación agregada en beta presente en la fibra amiloide parece originarse primeramente a partir de las hélices alfa parcialmente desplegadas. El estudio de mutantes con diferente propensión de agregación y estabilidad ha demostrado que las mutaciones producen cambios en la vía de agregación, pero que finalmente convergen en el mismo punto de fibrilación. Una posible función alternativa para uno de estos dominios, las cuales tienen una extraordinaria complejidad en comparación con otras secuencias inhibidoras en cis, ha sido buscada mediante herramientas bioinformáticas. Cierta similitud secuencial y estructural parece haber sido encontrada entre el dominio de activación de la procarboxipeptidasa A4 humana (ADA4h) y un dominio de unión a RNA (RRM), sugiriendo una posible función ancestral para el primero, aunque no todos los residuos clave para la interacción son presentes en ADA4h. La hipótesis ha sido comprobada experimentalmente mediante un gel de retardo, observándose una unión a RNA débil e inespecífica para el RNA ensayado, de acuerdo con lo que había sido predicho bioinformáticamente. Este hecho no excluiría una unión fisiológica y específica con otra molécula de RNA diferente a la ensayada.
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Bibliographical Information:

Advisor:Avilés Puigvert, Francesc Xavier; Villegas Hernández, Sandra

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:12/16/2008

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