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Rôle de la séquence P295-T311 dans l'activation du récepteur d'œstrogènes a;Activité pseudo-œstrogénique d'un peptide synthétique correspondant à cette séquence

by Gallo, Dominique

Abstract (Summary)
Le récepteur d'œstrogènes a (ROa), dont l'implication dans le développement du cancer du sein est clairement établie, appartient à la super-famille des récepteurs nucléaires qui sont des facteurs de transcription dont l'activité dépend d'un ligand régulateur, en l'occurrence le 17b-œstradiol. Le ROa régit l'expression de gènes nécessaires à la prolifération et à la différentiation cellulaire, ceci par association avec des séquences d'ADN situées à proximité de leur promoteur. Le ROa, une fois associé à son hormone, se défait des protéines qui le stabilisent dans une forme inactive (chaperonnes et corépresseurs) permettant ainsi le recrutement de protéines coactivatrices. Ces dissociations / associations se font de façon séquentielle selon un programme cyclique dans lequel la dégradation protéasomale du récepteur semble jouer un rôle clé. Les thérapies visant à contrecarrer la progression des cancers mammaires hormono-dépendants sont principalement basées sur l'inactivation du ROa. A cette fin et à ce jour, deux stratégies sont mises en œuvre: l'inhibition de la production d'œstrogènes (inhibiteurs d'aromatases) et l'inhibition du ROa lui-même (anti-œstrogènes). Face à l'apparition de résistances à ces traitements, la recherche de nouvelles cibles s'avère nécessaire. En effet, que ce soit de façon indirecte (inhibiteurs d'aromatases) ou directe (anti-œstrogènes), toutes les molécules utilisées en clinique ciblent la poche de liaison de l'hormone. Une autre approche visant à entraver l'action du ROa serait l'inhibition du recrutement de ses coactivateurs. Ainsi, il a été récemment rapporté que des peptides ou des mimes peptidiques inhibant de tels recrutements pourraient effectivement être d'utilité thérapeutique. Notre travail s'inscrit dans cette optique: l'étude du motif P295-T311 du ROa nous a permis de mettre en évidence une cible distincte de celles décrites ci-dessus. Ce motif semble être une région critique dans le contrôle de l'activité transcriptionnelle du ROa. Il est, en effet, sujet à phosphorylation, acétylation, méthylation, ubiquitination, SUMOylation et protéolyse. Par ailleurs, des études antérieures à ce travail ont suggéré son implication dans la liaison d'une protéine corégulatrice du ROa: la calmoduline (CaM), le principal senseur du calcium intracellulaire. Cependant, le rôle de cette association dans le processus d'activation du récepteur restait partiellement indéterminé. Afin d'étudier le rôle de la CaM dans ce processus, nous avons produit un peptide synthétique correspondant au motif P295-T311, l'ERa17p (séquence: P295LMIKRSKKNSLALSLT311). L'ERa17p se lie à une matrice de CaM-Sepharose de façon Ca2+-dépendante et inhibe la liaison du ROa à cette même matrice ce qui confirme que le motif P295-T311 est un élément essentiel pour la liaison de la CaM au ROa. De plus et au même titre que des molécules "anti-CaM", l'ERa17p est capable de dissocier les complexes ROa-CaM endogènes des cellules cancéreuses mammaires MCF-7. De façon remarquable, le peptide ERa17p présente un profil pharmacologique pseudo-œstrogénique en culture cellulaire. Il accroît, en effet, l'activité transcriptionnelle du ROa ainsi que la prolifération de lignées tumorales mammaires ROa-positives tout en étant inactif sur des lignées ROa-négatives. De plus, et de la même façon que pour les œstrogènes, ces effets sont liés à la diminution du taux de ROa. Une dégradation précoce du récepteur ainsi qu'une diminution ultérieure de sa synthèse sont à la base de cette "down regulation". L'activité pseudo-œstrogénique de l'ERa17p ne peut toutefois pas être attribuée à l'inhibition de la liaison ROa-CaM car des peptides analogues, dont certains acides aminés ont été substitués de façon à les rendre inactifs vis-à-vis de la CaM, présentent des propriétés biologiques similaires. Dans le but d'étudier les mécanismes engendrant l'œstrogénicité de l'ERa17p, nous avons synthétisé un analogue biotinylé qui nous a permis d'isoler une protéine stabilisatrice et coinhibitrice du ROa susceptible d'interagir avec l'ERa17p: l'Hsp70. La démonstration complémentaire que l'ERa17p entrave la liaison ROa-Hsp70 suggère que l'ERa17p pourrait être un inhibiteur compétitif de cette association. Par ailleurs, des études menées par modélisation moléculaire à partir de données cristallographiques du récepteur ont révélé l'existence d'une interaction intramoléculaire entre le motif S301-T311 et l'hélice 4 (H4) située dans un domaine de liaison de coactivateurs (H3-H5). Cette interaction pourrait prévenir le recrutement de ces coactivateurs, maintenant ainsi le ROa dans un état inactif. La mise en évidence de la liaison d'un ROa recombinant hautement purifié à l'ERa17p suggère que ce dernier pourrait aussi inhiber l'interaction S301-T311 – H4 et contribuer, de la sorte, à l'activation du récepteur. L'observation qu'un mutant de délétion pour le motif P295-T311 présente une activité transcriptionnelle constitutive élevée est en accord avec cette hypothèse et démontre le caractère répresseur de ce motif. Ainsi, nous avons démontré que la région P295-T311 possède une activité auto-répressive vis-à-vis de l'activation du ROa. Lorsque ce dernier se trouve dans un état inactif, l'Hsp70 serait associée à ce motif et maintiendrait le ROa dans une forme compacte (liaison intramoléculaire S301-T311 – H4) inapte au recrutement de protéines coactivatrices. En présence de son hormone, le récepteur se libérerait de l'entrave de l'Hsp70 ce qui permettrait son "ouverture" ("relaxation") et le recrutement de coactivateurs. La CaM s'associerait au ROa à ce stade, prévenant la réassociation de la chaperonne et empêchant tout retour à un état inactif. L'ERa17p jouerait donc le rôle de la CaM en inhibant, par compétition, la liaison de l'Hsp70 au ROa. D'autre part, étant donné l'implication de la dégradation du ROa dans son processus transcriptionnel, nous émettons l'hypothèse que le récepteur est régulé par des produits issus de cette dégradation; celle-ci engendrerait l'émergence de peptides régulateurs (ERa17p–like) capables d'amplifier les cycles transcription / dégradation initiés par le stimulus hormonal.
Bibliographical Information:

Advisor:Leclercq Guy

School:Université libre de Bruxelles

School Location:Belgium

Source Type:Master's Thesis

Keywords:era17p peptide récepteur d oestrogènes cancer du sein

ISBN:

Date of Publication:06/10/2009

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