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Ingeniería de anticuerpos aplicada al desarrollo y caracterización de biosensores enzimáticos

by Alcalá Morales, Pilar Lucía

Abstract (Summary)
Una de las aplicaciones de la ingeniería de proteínas es el desarrollo de biosensores moleculares como herramientas para la detección de sustancias mediante la interacción de una macromolécula y su ligando. De acuerdo a este principio se han generado una serie de prototipos de biosensores enzimáticos que han surgido a partir de la ingeniería de proteínas tales como la fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, b-lactamasa y la proteína TSP del bacteriófago P22. En todas estas enzimas modificadas se han insertado péptidos inmunoreactivos que actúan como sondas, en aquellos sitios permisivos de las superficies expuestas al solvente de cada enzima. La unión con anticuerpos anti-péptido da como resultado un aumento o una disminución en la actividad enzimática en una forma dependiente del título, lo que a su vez constituye un método simple para la detección y cuantificación de especies moleculares dentro de una mezcla compleja. Hasta el momento los únicos activadores descritos de los biosensores basados en enzimas son los anticuerpos y aún se desconoce el mecanismo por el cual se produce esta regulación enzimática. El principal objetivo de este trabajo ha sido determinar el tipo de interacciones moleculares que son necesarias para que se lleve a cabo la modulación de la actividad b-galactosidasa. Especialmente, se pretendía evaluar la necesidad de una unión bivalente para la reactivación y explorar la adaptación de los biosensores b-galactosidasa a la detección de ligandos monovalentes, como antígenos. Se evaluó la interacción molecular entre un péptido RGD recombinante del virus de la fiebre aftosa, expuesto en la superficie de una proteína portadora y sus receptores en la superficie celular. Como ligandos se utilizaron las integrinas avb3 y a5b1 solubles, así como células BHK21. Los resultados indicaron que ni las integrinas solubles ni aquellas expuestas en las células son capaces de modificar la actividad de sensores enzimáticos que por el contrario son activados por la unión de anticuerpos dirigidos contra el motivo RGD. Adicionalmente, se realizaron otros ensayos para determinar el impacto que podía tener la presentación múltiple de péptidos sobre la eficiencia de la unión a células. En este caso se observó que aumentando el número de segmentos virales mejoraba la unión de las proteínas recombinantes a las células. Se llevó a cabo el clonaje y producción en Escherichia coli de un fragmento scFv recombinante del anticuerpo monoclonal SD6, dirigido contra un péptido vírico antigénico, expuesto en un modelo de biosensor basado en la enzima b-galactosidasa. Los resultados indicaron que la unión del scFv no causaba ninguna respuesta enzimática mientras que la presencia simultánea del scFv y del fragmento Fab del SD6 daba como resultado una respuesta eficiente pero no aditiva del sensor, cuya actividad enzimática aumentaba hasta en un 200%. Este efecto cooperativo que también se pudo observar cuando se combinaban el scFv y el fragmento Fab de un anticuerpo no homólogo denominado 4C4, nos permitió postular que la reactivación enzimática requiere contactos múltiples y probablemente heterogéneos entre el sensor molecular y los analitos, y que no es necesaria la interacción con ligandos moleculares bivalentes para que se produzca dicha modulación de actividad. Por último, se evaluaron diferentes sitios tolerantes de la enzima b-galactosidasa para generar enzimas híbridas funcionales que presentaran el fragmento recombinante scFv del anticuerpo monoclonal SD6. La caracterización de las proteínas híbridas obtenidas indicó que al fusionar dicho fragmento al extremo amino-terminal de la enzima, la proteína era estable, mantenía su actividad específica e interactuaba con el antígeno hacia el cual estaba dirigido el fragmento de anticuerpo fusionado. Además la quimera scFvenzima era activa aún cuando se encontraba unida al antígeno y por lo tanto, se demostró su utilidad como reactivo en ELISA.
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Bibliographical Information:

Advisor:Villaverde, Antonio; Avilés, Francesc Xavier

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:02/28/2003

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