Precipitação de actomiosina de vertebrados por congelamento de fração solúvel

by Santos Dias, Decivaldo dos

RESUMO GERAL - Miosinas são proteínas motoras que translocam sobre filamentos deactina e atualmente constituem uma superfamília com 20 classes. Algumas sãoconhecidas apenas a estrutura primária através de seqüência gênica, outras jáestão bem caracterizadas bioquimicamente, como as miosinas I, II e V. Sãoamplamente distribuídas em todas as células eucarióticas. Apresentam comocaracterísticas bioquímicas: alta atividade ATPase na presença de EDTA e altaconcentração de potássio (atividade K/EDTA-ATPase) e uma baixa atividadeMg2+-ATPase, que é estimulada por F-actina. Preparação de actomiosina éobtida a partir da precipitação de fração solúvel de cérebro tanto em baixaquanto em alta força iônica e esse processo de precipitação constitui um passoimportante para purificar e caracterizar miosina II e V a partir de fração solúvelde cérebro. Miosina II é precipitada quando a fração solúvel de cérebro édializada contra tampão de baixa força iônica, enquanto que, miosina V éprecipitada seletivamente em relação à miossina II, quando a fração solúvel decérebro é tratada com alta força iônica, sendo postulado que essa precipitaçãode miosina (II e V) seja resultado de sua interação com actina e vesículas.Recentemente temos obtido a precipitação de actomiosina a partir docongelamento de fração solúvel de cérebro ou testículo de rato. Neste trabalhomostramos a purificação de miosina II de testículo de rato e a obtenção deactomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho através do congelamentode fração solúvel de cérebro e testículo.RESUMO - CAPÍTULO IActomiosina de testículo de rato foi obtida através do congelamento de fraçãosolúvel e miosina II foi isolada a partir dessa actomiosina. Testículos foramhomogeneizados em tampão de extração, centrifugado e o sobrenadante40.000g x 40? foi congelado a -20oC por 48 horas. O sobrenadante foidescongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45? e o precipitado foi lavadoduas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 9,0, respectivamente). O precipitadoresultante é enriquecido em três polipeptídeos: p205, p43 e um que migra juntocom a frente do gel. Esses polipeptídeos foram solubilizados em tampão pH 10,8a 27oC. O p205, isolado em Sephacryl S-400, co-sedimenta com F-actina naausência, mas não na presença, de ATP e foi marcado com anti-miosina II.Embora a preparação de testículo, praticamente, não expressou atividadeK/EDTA-ATPásica, uma preparação similar obtida a partir de músculoesquelético apresentou alta atividade K/EDTA-ATPásica. Nesse trabalho,miosina II foi isolada a partir de uma preparação de actomiosina obtida pelocongelamento de fração solúvel de testículo.RESUMO - CAPÍTULO IIActomiosina de cérebro de suino, bovino e pintainho foi obtida através docongelamento de fração solúvel e miosina II e V foram precipitadasconjuntamente, sendo que miosina de cérebro de suino foi parcialmente isoladaa partir dessa actomiosina. Os cérebros foram homogeneizados em tampão deextração, centrifugado e o sobrenadante 40.000g x 40? foi congelado a -20oC por48 horas. O sobrenadante foi descongelado a 4oC, centrifugado a 45.000g x 45?e o precipitado foi lavado duas vezes com tampão imidazol (pH 7,0 e 10,respectivamente). O precipitado resultante é enriquecido em três polipeptídeos:p205, p53, p43 e possui alta atividade Mg2+-ATPase. Esses polipeptídeos foramsolubilizados em tampão pH 10,2 a 27oC, com adição de ATP, Mg e NaCl. Op205 de cérebro de suino foi parcialmente isolado em Sephacryl S-500. Essepolipeptídeo de 205 kDa foi marcado com anticorpos anti-miosina II e V. Emboraa preparação de cérebro, praticamente, não expressou atividade K/EDTAATPásica,apresentou atividade Co2+-ATPase e uma estimulação da atividadeMg2+-ATPase por Tween 20. Nesse trabalho mostramos a precipitação conjuntade miosina II e V e o isolamento parcial dessas miosinas de cérebro de suino apartir de uma preparação de actomiosina obtida pelo congelamento de fraçãosolúvel de cérebro.