Caracterització de LAT4 i EEG1, dos membres de la família de transportadors d'aminoàcids SLC43

by Bodoy i Salvans, Susanna

RESUM DE LA TESI Els transportadors del sistema L faciliten el moviment daminoàcids grans i neutres a través de les membranes cellulars. Fins el moment es coneixien 3 proteïnes capaces dinduir aquesta activitat de transport: LAT1, LAT2 i LAT3. En aquets treball sha identificat LAT4, un nou transportador daminoàcids de la família SLC43 que guarda un 57% i un 30% didentitat amb LAT3 i EEG1, els altres dos membres de la família. La proteïna es glicosila i arriba a la membrana plasmàtica de les cèllules HeLa i dels oòcits de Xenopus laevis quan es sobreexpressa. El RNA missatger de LAT4 sexpressa majoritàriament a placenta, intestí i ronyó. Més concretament, mitjançant hibridació in situ, hem detectat el missatger de LAT4 a cèllules dels túbuls distals i dels conductes collectors del ronyó, i a les cèllules de la cripta i la base de lenteròcit a lintestí prim. Lexpressió de LAT4 en oòcits de Xenopus laevis indueix una activitat de transport daminoàcids neutres i grans; sodi, clorur i pH independent i que sinhibeix per lanàleg daminoàcids no metabolitzable BCH. Aquestes propietats concorden amb el subsistema prèviament descrit L2 i afegeixen un quart transportador responsable de lactivitat del sistema L. Lactivitat de transport induïda, no és transestimulable, i possiblement es tracti dun mecanisme de difusió facilitada. El transport induït per LAT4 mostra una cinètica de dos components, on les constants dafinitat són de 4,7+/-0,5 mM i 178+/-29 mil.limicres pel component de baixa i alta afinitat, respectivament. Lagent alquilant de grups sulfidrils, N-etilmaleïmida (NEM) inhibeix parcialment lactivitat de transport induïda per LAT4 i efecte específicament el component de baixa afinitat. A més a més, hem identificat el mutant LAT4 S297A insensible al pretractament amb NEM. Al model cellular de ronyó PCT, es detecta una activitat de transport de baixa afinitat a la cara basolateral compatible amb la descrita per LAT4. EEG1, el tercer membre de la família SLC43, es glicosila i expressat en sistemes heteròlegs arriba a la membrana plasmàtica de la cèllula, però no indueix activitat de transport pels aminoàcids assajats. El RNA missatger de EEG1 es detecta majoritàriament a cor, fetge, i en menor grau a ronyó, pulmó i placenta, tant en teixits humans com de ratolí. Sha generat un anticòs contra la proteïna que permet la seva detecció a ronyó, intestí i pulmó amb diferents patrons de glicosilació. També sha generat un model murí amb EEG1 mutat, mitjançant lexposició a lagent altament mutagènic etilnitrosurea (ENU). La mutació puntual detectada, introdueix un codó stop prematur concretament a la posició de la tirosina 221, que trunca la proteïna aproximadament a la meitat. Els ratolins homozigots per la mutació són viables, fèrtils i segueixen una herència mendeliana. No existeixen diferències pel que fa al pes dels animals mutants i control. No hiperexcreten aminoàcids en orina, ni tenen nivells elevats daminoàcids en sang. Presenten alteracions histopatològiques al ronyó i al fetge. Suggerim que EEG1 no té un paper rellevant en la reabsorció renal daminoàcids sense descartar una possible compensació per altres transportadors.