Details

Expressão da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela em células de inseto

by Campanhoni Machado, Tatiane Guerreiro

Abstract (Summary)
A febre amarela é uma doença hemorrágica causada por um vírus pertencente à família Flavivirus que é transmitido aos humanos através de picada por mosquitos. O vírus possui RNA fita simples, sentido positivo, com genoma de 10.862 nucleotídeos e uma única fase aberta de leitura ou ORF (do inglês: "Open Reading Frame") de cerca de 10.233 nucleotídeos. A ORF codifica três proteínas estruturais (capsídeo, pré-M e envelope) e 7 não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5), sendo que destas, a proteína do envelope é uma das mais estudadas devido ao seu alto potencial antigênico O isolamento de partes virais pode ser importante na utilização de antígenos para o desenvolvimento de novas vacinas e métodos diagnósticos. Na tentativa de isolar partes virais e expressá-las em separado são utilizados diferentes sistemas de expressão e dentre eles pode ser utilizado o sistema de expressão baseado em Baculovírus e células de inseto, que é um dos sistemas de expressão mais popular e eficiente. Baculovírus são vírus de DNA circular, dupla fita, que infectam artrópodes, principalmente os insetos. Existem muitas vantagens em se usar o sistema de expressão baseado em baculovírus e células de inseto, como altos níveis de expressão e modificações pós-traducionais, que permitem às proteínas recombinantes, serem montadas corretamente e biologicamente ativas. O gene do envelope do vírus da Febre Amarela foi isolado por técnica de RT-PCR, apresentando um tamanho de aproximadamente 1.600 pares de base. Em seguida, foi clonado em dois diferentes +plasmídeos de transferência: pSynXIV VIX3 e p2100, os quais foram co-transfectados, em células de inseto, com DNA de baculovírus recombinantes (vSynVI-gal, derivado do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), para o pSynXIV +X3 e vAgGalA2, derivado do Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), para o p2100. Sete dias após a transfecção o sobrenadante da cultura celular foi coletado e utilizado para purificar o vírus recombinante pelo método de diluição seriada em placa de 96 poços. Os vírus recombinantes vSynYFE e vAgGalA2 foram, então, utilizados para infectar células de Trichopluisa ni em cultura (BTI-Tn5B1-4) e lagartas de Spodoptera frugiperda (para o vSynYFE) e Anticarsia gemmatalis (para o vAgYFE). Células de inseto infectadas com o vírus vSynYFE mostraram efeitos citopáticos manifestados pela formação de sincício celular (que é típico da infecção por flavivirus) e a análise desse extrato celular por SDS-PAGE detectou a presença de um polipeptídeo de aproximadamente 50 kDa, similar ao tamanho da proteína do envelope do vírus da Febre Amarela. Entretanto, extratos de tecido adiposo de lagartas infectadas (96 h p. i.) analisadas por SDS-PAGE e western blot detectaram um polipeptídeo por volta de 70 kDa, maior do que o esperado para a proteína do envelope da Febre Amarela.
This document abstract is also available in English.
Bibliographical Information:

Advisor:Bergmann Morais Ribeiro; Silene de Paulino Lozzi; Cynthia Maria Kyaw; Carlos Andre Ornelas Ricart

School:Universidade de Brasília

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:febre amarela expressão proteína MEDICINA

ISBN:

Date of Publication:05/15/2007

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.