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Caracterização genômica da bactéria endossimbiótica do tripanosomatídeo Crithidia deanei e de suas DNA topoisomerases

by Foti, Leonardo

Abstract (Summary)
O principal objeto de estudo do presente trabalho são as DNA topoisomerases do tipo II do endossimbionte, devido ao seu papel essencial tanto nos processos replicação e transcrição, como também na recombinação e segregação dos cromossomos bacterianos. Existem duas topoisomerases do tipo II em bactérias: a DNA girase e DNA topoisomerase IV. A DNA girase introduz superenovelamento negativo no DNA circular, enquanto a topo IV tem como sua principal função a decatenação do DNA durante a segregação dos cromossomos. Para esses estudos foi gerada uma biblioteca genômica do endossimbionte em pUC18 e seqüenciados 7.500 clones inicialmente, abrangendo uma cobertura de 1,2 MB. As seqüências obtidas foram analisadas através do algoritmo BLAST. A análise mostrou que o genoma do endossimbionte apresenta uma grande homologia com os genomas de bactérias do gênero Bordetella, mas diferem no conteúdo A+T, que no genoma do endossimbionte é de aproximadamente 70%, enquanto que no gênero Bordetella é de apenas 32%. Esta estratégia permitiu encontrar as seqüências dos genes que codificam as subunidades A (GyrA)eB (GyrB) da DNA girase. Identificamos também o gene que codifica a topoisomerase III (topo III), mas não fomos capazes de identificar os genes que codificam as enzimas topo IV e topo I (topoisomerase I), que formam juntamente com a DNA girase e topo III o repertório de topoisomerases encontrado em outras bactérias. Baseados nas seqüências dos genes gyrA e gyrB foram desenhados iniciadores para amplificação dos alvos através de PCR. Os produtos das amplificações foram clonados para expressão em E. coli. As proteínas recombinantes foram purificadas para a produção de antissoros policlonais. Ensaio de western blot identificou polipeptídeos específicos com massas moleculares similares àquelas preditas a partir da seqüência dos genes gyrA e gyrB. Análise por imunofluorescência mostrou que os antissoros contra as subunidades A e B da DNA girase reconhecem antígenos específicos do endossimbionte, inoculados por todo o citoplasma da bactéria. Os genes gyrA e gyrB também foram expressos no sistema de expressão de baculovírus, para facilitar a obtenção de proteínas recombinantes solúveis. As duas subunidades foram purificadas em resina de afinidade a metal quelante (Ni-NTA). Outro resultado importante do trabalho foi a identificação de genes cujos produtos fazem parte de vias de biossíntese de vários metabólitos necessários para a célula hospedeira, tal como a ornitina transcarbamoilase, envolvida no metabolismo da ornitina, identificada a partir de estudos bioquímicos.
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Bibliographical Information:

Advisor:Stenio Perdigão Fragoso

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:crithidia genoma dna topoisomerases tipo ii deanei genome type biologia e fisiologia dos microorganismos

ISBN:

Date of Publication:10/03/2006

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