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Purificação da adesina fimbrial F1845 de Escherichia coli de aderência difusa (DAEC), para produção de soro policlonal.

by GRAVA, ANDRÉA FAGUNDES

Abstract (Summary)
Escherichia coli de aderência difusa (DAEC) é uma das 6 classes de E.coli diarreiogênica e está associada a diarréia persistente em crianças abaixo de 5 anos de idade. Os fatores de virulência das cepas de DAEC estão associados principalmente às adesinas, pertencentes a família Afa/Dr, tais como AfaE-I e AfaE-III, Dr e DR-II, e F1845. Em estudos de caso e controle, realizados em Porto Velho-RO, a DAEC aparece como causa de diarréia em 7.4% das crianças menores de 5 anos. Técnicas de PCR não estão sendo específicas para a detecção DAEC e a maioria das amostras foram identificadas apenas pelo seu padrão de adesão AD em ensaio celular às células HEp-2. Observando estas dificuldades de identificação do patógeno, este trabalho de pesquisa teve por objetivo produzir um soro policlonal para a identificação de amostras de DAEC, para que este soro possa ser utilizado por laboratórios de análises clinicas e rede pública de saúde. Visando um rápido diagnostico deste enteropatógeno, uma vez que não existem testes sorológicos para esta caracterização. Selecionamos a região do gene que codifica para a adesina F1845, e construímos primers específicos que amplificam para a região de interesse. O material foi clonado no plasmídio pGEX-3X, purificado e inoculado em coelhos para a produção do soro anti F1845 (a proteína F1845 purificada foi uma etapa importante para a especificidade da resposta imunológica das cobaias). Para a confirmação do anticorpo anti-F1845, foram feitos testes de Detecção de antígeno- anticorpo, ELISA e Western Blot contra a proteína recombinante e GST pura. Através de precipitação de Proteína em Sulfato de Amônio (semi-purificação) e em coluna de Proteína A ? Cromatografia de Afinidade IgG o soro foi purificado, para posterior desenvolvimento de um teste rápido para a identificação de DAEC que se mostra importante, um vez que não existem atualmente metodologias que superem as vantagens dos testes sorológicos de aglutinação. Os processos de identificação deste patógeno por outras vias (moleculares ou por ensaios celulares) são muito dispendiosos em termos financeiros e de tempo empregado em sua execução. A rápida e eficaz identificação deste patógeno, é primordial para o correto tratamento e conseqüente controle das doenças diarreiogênicas associadas à DAEC.
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Bibliographical Information:

Advisor:Patrícia Puccinelli Orlandi

School:Fundação Universidade Federal de Rondônia

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:BIOLOGIA GERAL

ISBN:

Date of Publication:12/01/2005

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