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Caracterização da N-Glicosilação de DM43 e DM64 por espectrometria de massas e análise de sua contribuição para a atividade antiofídica destas proteínas.

by León, Ileana Rodríguez

Abstract (Summary)
Em países tropicais e subtropicais, o envenenamento por picadas de venenos de serpentes é um problema de saúde pública. A mortalidade global estimada é de 50 a 100 milcasos por ano. Entretanto, há um elevado número de subnotificações no que tange os índices de morbidade, seqüelas que incluem ulceração crônica, falência renal, dano neurológico e amputações. O tratamento atual é baseado na administração de antisoro de origem animal produzido contra as toxinas antigênicas presentes nos venenos. Contudo, o antiveneno é ineficaz no tratamento do dano tecidual local e sua administração pode provocar sérias reações adversas. Alguns animais apresentam resistência natural ao envenenamento por serpentes, principalmente devido à presença de fatores séricos neutralizantes. O marsupialDidelphis aurita é resistente ao veneno de várias serpentes da família Viperidae e do seu soro foram isoladas duas proteínas com atividades anti-hemorrágica (DM43) e antimiotóxica(DM64). DM43 e DM64 são glicoproteínas ácidas omodiméricas apresentando 21% e 15% de conteúdo de carboidrato por peso, respectivamente. O objetivo desse trabalho foi implementar e desenvolver diferentes técnicas analíticas para glicoproteínas, utilizando estes inibidores como modelo. Os diferentes peptídeos e glicopeptídeos gerados, após hidrólise enzimática, foram analisados por espectrometria de massas. As estruturas oligossacarídicas ea atividade biológica dos inibidores, após desglicosilação total ou parcial, também foram analisadas. Utilizando digestões seqüênciais com três diferentes proteases, com e semdigestão prévia com PNGase F, aliadas à análise por MALDI-TOF/TOF, quatro sítios de Nglicosilação foram confirmados em DM43 (Asn23, Asn156, Asn160 and Asn175) e outros quatrodeterminados experimentalmente em DM64 (Asn46, Asn179, Asn183 and Asn379). Estruturas de oligossacarídeos do tipo complexo, contendo galactose e ácido siálico, foram encontradas para ambas proteínas. Também determinamos que a desglicosilação parcial não apresentou efeito mensurável na atividade biológica dos inibidores. Por outro lado, a desglicosilação de DM43 com PNGase F, em condições nativas, originou diversas espécies desglicosiladas elevou a um decréscimo de cerca de 50% em sua capacidade inibitória frente à atividade azocaseinolítica da metaloproteinase jararagina. Pela primeira vez, demonstrou-se a importância da porção glicídica desses inibidores para suas atividades biológicas. Apesar das Asn23 (DM43) e Asn379 (DM64) não parecerem estar envolvidas nessas interações, as outras N-glicosilações presentes podem ter um papel relevante em estabilizar as estruturas homodiméricas nativas dessas moléculas e/ou na formação/manutenção dos complexos nãocovalentes inativos formados entre monômero de inibidor e molécula de toxina.
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Bibliographical Information:

Advisor:Richard Hemmi Valente; Jonas Enrique Aguilar Perales

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Imunidade Natural Espectrometria de Massas Venenos Serpentes

ISBN:

Date of Publication:03/17/2008

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