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Valor de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

by Menendez, Manuel, MD


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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

II. OBJETIVOS
En el presente trabajo de investigación y una vez analizado en profundidad
el estado actual del problema, nos hemos planteado los siguientes objetivos:

Objetivos generales
1. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de

neurosina en el diagnóstico diferencial del deterioro cognitivo de
origen vascular, degenerativo o psiquiátrico.
2. Estudiar la utilidad de la medición de la concentración plasmática de

neurosina como factor pronóstico en pacientes con Deterioro
Cognitivo Leve.

Objetivos específicos
Objetivos específicos para el objetivo general número 1
a. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía con la

edad en individuos sanos.
b. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre

pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen y controles.
c. Determinar si la concentración plasmática de neurosina difiere entre

pacientes con deterioro cognitivo de distinto origen.
d. Determinar si la concentración plasmática de neurosina varía en las

distintas fases evolutivas de la Enfermedad de Alzheimer.
e. Determinar en qué situaciones clínicas la cuantificación plasmática de

neurosina puede ser de utilidad en el diagnóstico diferencial entre
entidades distintas causantes de deterioro cognitivo.

Objetivos específicos para el objetivo general número 2
a. Determinar si una única medición de la concentración plasmática de

neurosina es de utilidad como factor pronóstico en pacientes con
Deterioro Cognitivo Leve.
b. Determinar si la evolución de la concentración plasmática de

neurosina es un parámetro de utilidad para establecer el pronóstico
de pacientes con Deterioro Cognitivo Leve.

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METODOLOGÍA
1. Diseño:
No experimental (observacional), prospectivo, cuantitativo, casos y controles
no pareados. Se han seguido los estándares y recomendaciones de la iniciativa
STARD [43, 44] para la validación de pruebas diagnósticas.

2. Sujetos de estudio:
2.1 Muestreo, reclutamiento y selección de pacientes:
Se siguió un método de muestreo y reclutamiento consecutivo; en el que a
partir de la fecha de inicio del estudio (Enero 2003) a todos los pacientes
estudiados por Unidad de Demencias del Hospital Universitario Central de Asturias
(HUCA) que cumplían el criterio de screening y ningún criterio de exclusión se les
propuso participar en el estudio (Tabla 4). El periodo de reclutamiento fue de 36
meses.

2.2 Criterio de screening:
Pacientes con síntomas cognitivos en los que se sospecha origen vascular,
degenerativo o psiquiátrico.

2.3 Criterios de inclusión:
Se incluyeron directamente tras el screening todos los pacientes con
Deterioro Cognitivo Leve sin criterios de exclusión. Pacientes en los que tras al
menos un año de seguimiento se establece el diagnóstico de EA, Demencia por
Cuerpos de Lewy o Parkinson-Demencia, Demencia Frontotemporal, Enfermedad de
Huntington, Afasia Progresiva Primaria, Degeneración Córticobasal, Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob o Enfermedad Psiquiátrica con síntomas cognitivos.

2.4 Criterios diagnósticos y de estadiaje:
El diagnóstico de las enfermedades se estableció según los siguientes
criterios: Criterios NINCDS-ADRDA [45] para la enfermedad de Alzheimer, criterios
del Consortium on Dementia with Lewy Bodies [46] para la demencia por cuerpos
de Lewy, criterios de Manchester y Lund [47] para la demencia frontotemporal,
Criterios NINCDS-AIREN [48] para el diagnostico de Demencia Vascular (Demencia
con Componente Vascular), criterios de la OMS para Enfermedad de Creutzfeldt-
Jakob [49], Criterios DSM-IV para el diagnóstico de los cuadros psiquiátricos con
síntomas cognitivos (Pseudodemencia) [1], criterios de Petersen para DCL [3]. El
diagnóstico de enfermedad de Huntington se realizó por confirmación genética.

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El estadiaje de la enfermedad de Alzheimer (1-6) se realizó según los
criterios GDS-FAST-BCRS [50]. Controles: GDS1, DCL: GDS3, EA leve: GDS4, EA
moderada: GDS5, EA severa: GDS6.

2.5 Criterios de exclusión:
Pacientes con algún tipo de “demencia tratable” (tumoral,

hidrocefalia, carencial, tóxica o asociada a otras enfermedades).
Pacientes con enfermedad oncológica conocida.
Pacientes con alteración de la función hepática o renal (en los que

puede alterarse la metabolización o aclaramiento de proteínas
plasmáticas).
No obtención del consentimiento informado por el paciente o tutor del

mismo.

2.6 Muestras procedentes de otros centros:
Ante la previsión de reclutar un número muy escaso de muestras de
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, y conscientes de que se trata de un
procedimiento de reclutamiento con menor validez metodológica ya que estos
sujetos no siguieron el protocolo general del estudio, solicitamos a un centro de
referencia (Hospital Clinic i Universitari de Barcelona) muestras de sujetos con esta
enfermedad, de las que nos facilitaron 29 muestras procedentes de pacientes que
habían sido diagnosticados con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob probable (n=11) o
definitiva (n=18).

2.7 Fuentes de controles
Los controles se obtuvieron de dos fuentes distintas: a) individuos sanos o
pacientes estudiados en consulta de Neurología del HUCA por patología del sistema
nervioso periférico, sin evidencia de patología del sistema nervioso central o
acompañantes sanos (esposos) de los pacientes de edad superior a 60 años, b)
muestras procedentes del Centro Comunitario de Sangre y Tejidos (HUCA), de edad
entre 18 y 60 años.

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Controles
Consulta de Neurología (HUCA) (> 60 años) 70
Centro Comunitario de Sangre (< 60 años) 158
Total de controles incluidos 228

Pacientes
Screening en consulta de neurología (HUCA) 633

- Perdidos / No reclutables 186
Pacientes incluidos desde consulta (HUCA) 418
Muestras del Hospital Clinic 29
Total de pacientes incluidos 447
Tabla 4. Resumen de las fuentes y número de controles y
pacientes reclutados.

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3. Metodología clínica:
Para el estudio de pacientes con deterioro cognitivo se siguieron las
recomendaciones de la Academia Americana de Neurología [51]. El diagnóstico se
estableció en todos los casos, excepto en los pacientes con DCL, a los 12 meses de
la inclusión del sujeto en el estudio. En los pacientes con DCL el diagnóstico se
estableció en cuanto se realizó la evaluación y las pruebas complementarias.

3.1 Estudio clínico de los pacientes
Se empleó un protocolo que incluye: anamnesis completa, exploración física
general y neurológica, evaluación neuropsicológica con Test Generales (MMSE de
Folstein [52], Subtest de Memoria del Test Barcelona Abreviado [53]) y específicos
(orientados en función de la sospecha diagnóstica); evaluación funcional: Escala de
Blessed [54]; test de despistaje de enfermedad psiquiátrica: Inventario
Neuropsiquiátrico de Cummings [55] y Escala de depresión geriátrica de Yesavage
[56].

3.2 Pruebas complementarias realizadas
A todos los pacientes se les realizaron las siguientes pruebas
complementarias: hemograma, bioquímica general, TSH, acido fólico, vitamina B12,
serología lúes y Lyme (realizados en los servicios de Bioquímica, Microbiología del
HUCA) y prueba de neuroimagen: Tomografía computerizada y/o Resonancia
Magnética Craneal (en el Servicio de Radiología del HUCA).
En casos seleccionados se realizaron otras pruebas que se consideraron
necesarias para alcanzar el diagnóstico, tales como genética para Enfermedad de
Huntington, medición de niveles de homocisteína, vitamina A, ceruloplasmina y
electroencefalografía.
A todos los pacientes con el diagnóstico de EA se les determinó el genotipo
ApoE en el laboratorio de Genética Molecular del HUCA.

3.3 Seguimiento de pacientes con DCL
Los pacientes con DCL fueron seguidos durante 18 meses con visitas cada 6
meses en las que se realizaba una reevaluación funcional. Al final del seguimiento
se repitió el estudio de neuroimagen y evaluación neuropsicológica completa. Con
todos estos datos, junto a la valoración clínica, se reconsideró el diagnóstico del
paciente.

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4. Obtención de muestras y metodología de laboratorio para la
cuantificación de neurosina:
La obtención de las muestras de sangre y las condiciones de
almacenamiento fueron idénticas para todos los sujetos incluidos en el estudio
excepto para las muestras remitidas desde el Hospital Clinic de Barcelona. Las
muestras de sangre se obtuvieron en el servicio de extracciones del Hospital
Universitario Central de Asturias, en tubo de tapón rojo (sangre coagulada) y en
cantidad de 10 ml. Las muestras se procesaron para obtener el suero en el
laboratorio de nuestro hospital del modo siguiente: se permitió la coagulación
durante 30 minutos, se centrifugó la muestra durante 10 minutos a 3,500 g. Se
recogió el sobrenadante y se hicieron varias alícuotas de la muestra de 5 ml que se
congelaron a -80º C. Se obtuvo una segunda muestra a los 18 meses de la primera
en 36 pacientes con DCL de los 66 a los que se les realizó seguimiento.
La determinación de las concentraciones séricas de neurosina se realizó en el
Servicio de Inmunología del HUCA. Se utilizó un inmunoensayo comercializado (Kit
para hk6) de IBEX (human kallikrein 6 research ELISA, IBEX, Canada) con dos
anticuerpos monoclonales de ratón siguiendo las instrucciones del proveedor. Este
inmunoensayo no presenta inmunoreactividad cruzada con otras kallikreínas y tiene
una precisión con un margen de error inferior al 4%. El kit está basado en un
inmunoensayo previamente descrito por Diamandis y cols. [57]. Consiste en un
inmunoensayo tipo “sandwich” en el que se utiliza neurosina recombinante
standard, un anticuerpo monoclonal antineurosina de ratón y un segundo
anticuerpo monoclonal antineurosina conjugado con biotina; ambos dentro de una
matriz estabilizante con BSA. La unión del anticuerpo biotinilado se detectó
mediante la unión de un conjugado de estreptavidina con el enzima peroxidasa y la
adición de tetrametilbenzidina. Los dos anticuerpos monoclonales de neurosina de
ratón usados en este inmunoensayo son específicos para la neurosina y no
muestran inmunoreactividad cruzada contra las kalikreínas recombinantes humanas
purificadas 2, 3 (PSA), 5, 8, 10 y 13. La precisión intra-ensayo de este ELISA es
CV<3.97 y la precisión interensayo es CV< 7.22. La curva standard se generó con
diluciones standard de neurosina recombinante entre 0.2 y 20 ng/ml.

5. Recogida de Datos y Variables
Los datos de los pacientes se ordenaron consecutivamente por orden de
inclusión en forma de doble registro anonimizado mediante bases de datos
disociadas: una con número de historia y código y otra con código y datos.

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Los datos de los resultados de laboratorio se recogieron inicialmente en cuaderno y
posteriormente se introdujeron en el programa informático SPSS 14.1 junto al
código del paciente.

5.1 Variables Primarias:
Diagnóstico: para todos los individuos incluidos en el estudio se

realizó un diagnóstico (único y excluyente) que representa una
variable cualitativa nominal que se codificó numéricamente. En los
pacientes con DCL además del diagnóstico inicial se recogió el
diagnóstico a los 18 meses de seguimiento.

Valor de la concentración sérica de neurosina: variable cuantitativa
continua. Se ha recogido su valor incluyendo dos decimales

5.2 Variables Secundarias:
Edad: variable cuantitativa discontinua, su valor se ha recogido en

números enteros (sin decimales ni fracciones).
Sexo: variable dicotómica que se codificó: 1:hombres, 2:mujeres
Genotipo ApoE: es el genotipo Apo E, que representa una variable

cualitativa nominal que permite 6 posibilidades genotípicas como
combinación de 2 alelos de 3 tipos, se codificó: 1:2,2; 2:2,3; 3:2,4;
4:3,3; 5:3,4 y 6:4,4

6. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se ha utilizado el programa informático SPSS,
versión 14.1 bajo el asesoramiento de la unidad de investigación y estadística de la
Oficina de Investigación Biosanitaria del Principado de Asturias.
Mediante T de Student para comparación de medias se comparó la edad
media de controles y pacientes con EA. Se realizaron test Chi-cuadrado para
evaluar las diferencias en la distribución por sexo en controles y pacientes con EA.
Mediante el test de Kolmogorov-Smirnov se comprobó que la concentración
plasmática de neurosina sigue una distribución normal en pacientes y controles.
Mediante el coeficiente de correlación de Pearson se estudió la correlación de la
concentración plasmática de neurosina y la edad de pacientes y controles. Mediante
test T de Student se comparó si existen diferencias en la concentración media de
neurosina entre controles mayores y menores de 60 años y entre sexo masculino y
femenino tanto en controles como en pacientes con EA, también se comparó la
media en pacientes con EA portadores de un alelo E4 con los no portadores de alelo

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E4. Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias de
las concentraciones plasmáticas de neurosina entre todos los grupos.
Se calculó la sensibilidad, especificidad y valores predictivo positivo y
negativo de la prueba en el diagnóstico diferencial entre aquellos grupos
diagnósticos cuyas medias mostraron diferencias significativas. El valor de corte
óptimo se ha determinado hallando el punto con mejor valor promedio de
sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de EA. Se crearon curvas ROC con
ayuda del programa Rockit 09.1beta y se calculó el área bajo la curva de esta
prueba para la EA.
Mediante test ANOVA y corrección de Bonferroni se compararon las medias
de concentración de neurosina entre los distintos grupos de DCL tras el
seguimiento. Se realizaron tests Chi-cuadrado con dos grados de libertad para
determinar si hay relación entre la existencia de progresión clínica y los niveles
plasmáticos de neurosina dicotomizados en “altos” y “bajos”. Se realizó un análisis
de regresión logística para determinar la probabilidad de cada diagnóstico en
función de los niveles dicotomizados de neurosina corrigiendo los resultados para
las variables demográficas sexo y edad.
Finalmente se correlacionó, mediante el coeficiente de correlación de
Pearson, los niveles de neurosina con el estadio evolutivo de EA.

7. Consideraciones éticas y legales
Este proyecto de investigación fue aprobado por los Comités de
Investigación y Ético del Hospital Universitario Central de Asturias (HUCA).
Este estudio se ha regido por las bases éticas del Convenio de Oviedo
siguiendo sus normas de información y consentimiento informado, y por los
principios de la Declaración de Helsinki, del Consejo de Europa relativo a los
derechos humanos y la biomedicina, de la Declaración Universal de la UNESCO
sobre los derechos humanos y los requisitos de la legislación española incluyendo la
“Ley de investigación con seres humanos”.
Los datos se han tratado con carácter confidencial. La identidad de los
pacientes se ha salvaguardado mediante la creación de un registro disociado y se
ha cumplido la normativa de la Ley de Protección de Datos.

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II. RESULTADOS
1. Descripción de la muestra
1.1 Características de los individuos incluidos
Inicialmente se incluyeron 633 individuos en el screening del estudio, de los
cuales 186 no cumplieron finalmente los criterios de inclusión o fueron perdidos
durante el seguimiento inicial (Tabla 4). Además se incluyeron las muestras de 228
controles y muestras de 27 pacientes con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
procedentes del Hospital Clínico de Barcelona. Por lo tanto se estudiaron muestras
de 675 individuos, 423 mujeres y 252 hombres repartidos en los grupos
diagnósticos descritos en la Tabla 5.

Frecuencia Edad Sexo
Femenino Masculino
N % Media

Tabla 5. Distribución de la muestra en grupos diagnósticos y variables demográficas.
Desviación
Standard N % N %
Controles 228 33.8 50.24 17.77 143 21.18 85 12.59

Mayores de 60 años 70 10,3 77,84 7,88 41 6,07 29 4,29
Menores de 60 años 158 23,4 38,05 21,54 102 15,11 56 8,29
Enfermedad de Alzheimer 199 29.4 80.01 6.76 130 19.25 69 10.22

EA leve 84 12.4 79.02 6.99 48 7.11 36 5.33
EA moderada 79 11.7 80.50 6.57 58 8.59 21 3.11
EA severa 36 5.3 81.25 6.50 24 3.55 12 1.77
Deterioro Cognitivo Leve 68 10.1 76.30 8.30 47 6.96 21 3.11
Demencia con comp. Vasc. 80 11.8 75,36 8,67 38 5,62 42 6,22

Demencia mixta 28 4.1 77.14 7.97 18 2.66 10 1.48
Demencia vasc. 52 7.7 74.40 10.72 20 2.96 32 4.74
Demencia Frontotemporal 20 3.0 75.00 9.52 10 1.48 10 1.48
Pseudodemencia 18 2.7 73.11 9.00 13 1.92 5 0.74
Afasia Progresiva Primaria 6 0.9 73.83 6.79 4 0.59 2 0.29
Demencia con C. de Lewy 18 2.7 75.72 12.56 11 1.62 7 1.03
Enfer. de Creutzfeldt-Jakob 29 4.3 64.89 10.89 21 3.11 8 1.18
Degeneración Corticobasal 2 0.3 74.00 15.55 1 0.14 1 0.14
Enfermedad de Huntington 1 0.1 70.00 0 1 0.14 0 0
Otras 6 0.8 80.33 6.47 4 0.59 2 0.29
Total 675 100.0 67.85 17.92 423 62.66 252 37.33

En el grupo “otras” se incluyen 6 pacientes en los que inicialmente se había
diagnosticado enfermedad psiquiátrica pero cuyo curso evolutivo fue hacia
demencia que no se ha podido clasificar en el momento de finalizar el estudio.

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1.2 Diferencias de edad y sexo entre controles y pacientes
Para evaluar si existen diferencias en la edad y el sexo de pacientes con EA
y controles comparamos en ellos la distribución de estas variables. Los resultados
demuestran que no hay diferencias significativas en el sexo entre controles y
ningún tipo de demencia (para grupos diagnósticos con n25). Sin embargo, sí hay
diferencias significativas en la edad entre controles y todos los grupos de pacientes
(p=0.014) lo que podría ser fuente de sesgos. Por ello, para las comparaciones de
niveles de neurosina entre casos y controles, se tomaron como controles el grupo
de controles mayores de 60 años.

1.3 Evolución diagnóstica de los pacientes con DCL
De los 68 pacientes con DCL incluidos se consiguió seguir a 66 hasta 18
meses tras el diagnóstico. Se mantuvieron estables 30 casos (45,4%). Veintitrés
pacientes (34,8%) desarrollaron EA (de acuerdo con los criterios NINCDS-ADRDA
[45]) y 13 (19,7%) desarrollaron Demencia con Componente Vascular (de acuerdo
con los criterios NINCDS-AIREN [48]). Por tanto, la tasa global de conversión anual
(porcentaje de pacientes que evolucionan de DCL a demencia en un año) fue
36,4%.

2. Neurosina en controles
2.1 Correlación de los niveles de neurosina con la edad en controles
El valor medio de neurosina en el grupo control fue 4,44 ng/ml. Dado que las
demencias son un trastorno asociado a la edad, valoramos si en los sujetos sanos
la concentración de neurosina también variaba con la edad. Efectivamente, existe
una correlación positiva entre estas variables (Factor de correlación de Pearson:
0,362, RSQ= 0,131, significación bilateral p<0,001). Tal como se muestra en la
Figura 12, a mayor edad de los controles, mayor nivel de neurosina. Las diferencias
en los niveles de neurosina en los controles mayores de 60 años (valor medio de
neurosina 5,52 ng/ml) y en los menores de 60 años (valor medio 3,97 ng/ml)
difieren significativamente (p=0,027) (Figura 11).

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