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Valor de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

by Menendez, Manuel, MD


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Utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial de las demencias

2.2 Expresión de la neurosina
La neurosina es una serín-proteasa de 244 aminoácidos y un peso molecular
de 26856 Da “similar a tripsina” como demuestran los datos de cristalización [14]
[15] (Figura 3).

A B

Figura 3: Representación tridimensional de la neurosina. A. Los residuos catalíticos se
muestran como bolas y barras. La histidina 57 en azul, el ácido aspártico 102 en rosa y la
serina 195 en naranja. B. Regiones en bucle que rodean el sitio activo: 92–102 (azul), 141–
152 (rosa) y 172–178 (verde). Tomado de Bernett [9].

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El gen de la neurosina se
encuentra localizado en el cromosoma
19q13.3-q13.4, y está compuesto de 7
exones de los cuales los dos primeros
no se transcriben [16]. Tiene una pauta
abierta de lectura de 732 pares de
bases que codifican una proteína de
244 aminoácidos sintetizada como prepro-hK6.
Una vez el péptido señal es
liberado la pro-hK6 es secretada al
medio extracelular, donde un nuevo
corte produce la forma activa de 223
aminoácidos. Se ha señalado que la
propia neurosina puede provocar su
propia activación e inactivación [14, 17,
18] (Figura 4). Sin embargo la
capacidad de la propia neurosina de ejecutar estos pasos se ha puesto en duda y es
objeto de debate [14, 18, 19].

Figura 4. Representación esquemática de los 2
pasos autoproteolíticos que llevan a la
maduración de pro-hk6 (activación) y la
subsecuente autoinactivación de la misma
(Modificado de Bayés).

La neurosina se expresa en el sistema nervioso central, epitelio glandular de
mama, próstata, riñón, endometrio, colon, apéndice, glándulas salivares, conductos
biliares y vejiga, intestino delgado, estómago, endocervix, trompa de Falopio,
epidídimo, bronquios, tracto respiratorio superior y en células endoteliales, nervios
periféricos y algunas células neuroendocrinas (incluyendo los islotes de Langerhans,
células de la porción anterior de la hipófisis y la médula adrenal) [20, 21] (Figuras
2 y 5). El órgano donde más neurosina se expresa es el cerebro; en concreto se ha
encontrado en el epitelio del plexo coroideo, en la corteza cerebral, en el cerebelo y
en el hipocampo [20].

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Figura 5. Intenso inmunomarcaje de neurosina (cabezas de flecha) en el epitelio del plexo
coroideo (A) y (B). Inmunoexpresión de neurosina en neuronas (C). Inmunoexpresión de
neurosina en nervio periférico (D). Anticuerpo policlonal, magnificación x200. Tomado de
Petraki [21].

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2.3 Actividad enzimática de la neurosina
Como se ha dicho, la neurosina es una de las kalikreínas tisulares y por
tanto su presencia en los fluidos biológicos se debe a difusión a éstos desde los
tejidos. La neurosina presente en liquido cefalorraquídeo corresponde a la proteína
completa (proenzima) sin procesamiento de la región pro como lo demuestra el
hecho de que su secuencia N-terminal sea Glu-Glu-Gln-Asn-Lys y por lo tanto
presumiblemente inactiva [15, 22].
Algunas de las proteínas descritas como sustratos de la neurosina son la
proteína básica de la mielina (MBP) [19], el plasminógeno [17], la α1-antitripsina,
la proteína precursora del amiloide (PPA) [19] y el receptor ionotrópico del
glutamato [23].
La neurosina posee la actividad proteolítica propia de las kalikreínas. En las
secuencias de substrato existe exclusividad para la Arginina en P1 y alta
especificidad para Serina en P1’ [23]. Las principales secuencias sustrato de la
neurosina se recogen en la Tabla 3.

Sustrato
Boc-Gln-Ala-Arg-NHMec
Boc-Phe-Ser-Arg-NHMec
Boc-Val-Pro-Arg-NHMec
Bz-Arg-NHMec
Tos-Gly-Pro-Arg-NHMec
Tos-Gly-Pro-Lys-NHMec
Punto de Corte
Boc-Gln-Ala-Arg+NHMec
Boc-Phe-Ser-Arg+NHMec
Boc-Val-Pro-Arg+NHMec
Bz-Arg+NHMec
Tos-Gly-Pro-Arg+NHMec
Tos-Gly-Pro-Lys+NHMec
Tabla 3: Secuencias de algunos de los puntos de corte conocidos de la neurosina.
Fuente: MEROPS. Identificador Peplist PL00322.

La unión al sustrato se produce en la proximidad del centro activo de la neurosina.
Para ello, la Arginina forma puentes de Hidrógeno con los residuos Asp189, Ser190 y Asn217
[14, 23, 24] (Figuras 6 y 7).

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A B

Figura 6. Diagrama propuesto mediante simulación para la unión de la neurosina al sustrato
alrededor del centro activo. A. La Arginina es responsable de realizar puentes de Hidrógeno
con los residuos Asp189, Ser190 y Asn217 que constituyen el principal dominio activo de la
neurosina. A. Tomado de Li [23]. B. Tomado de Bernett [9].

Figura 7. Unión del péptido al sustrato en orientación standard. A, sitio activo de corte
junto a un sustrato hexapeptídico (P4-Val-P3-Ala-P2-Arg-P1-Arg- -P1'-Ala-P2'-Ala). B, sitio
activo de corte, representado como superficie sólida coloreada de acuerdo con los
potenciales electroestáticos de superficie (azul estremo positivo y rojo extremo negativo),
junto al hexapéptido VARRAA que se une a los sitios S4 a S2'. Tomado de Debela [24]

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2.4 Neurosina y PARs
Recientemente se ha descubierto la relación de las Kalikreínas con los PARs
(receptores activados por proteasas). Los PARs constituyen una familia de
receptores acoplados a proteína G que funcionan a través de un mecanismo único
de activación mediante corte proteolítico de su extremo amino terminal exponiendo
así un ligando peptídico [25] (Figura 8). Se sabía que los PARs 1-4 son activados
por hidrólisis de la trombina (PAR-1 y PAR-3), de la tripsina (PAR-2) o tanto por la
tripsina como por la trombina (PAR-4) [26], pero recientemente se ha demostrado
que las kalikreínas también activan los PAR [27, 28] y por tanto deben considerarse
como importantes reguladores “hormonales” de la función tisular.

Figura 8. Estructura y mecanismo de activación de los PARs por las tripsinas cerebrales. Los
PARs tienen siete dominios transmembrana en hélice y una hélice adicinal C-terminal
intracelular. El corte proteolítico mediante serín-proteasas, tales como la neurosina, se
expone un nuevo dominio N-Terminal que actúa como ligando proteico (segmento en caja)
que puede intereactuar con el segundo bucle extracelular (línea de puntos) alterando la
conformación del receptor, lo que facilita el acoplamiento de los bucles intracelulares 2 y 3
del PAR con la proteína G que transmite las señales intracelularmente. Tomado de Wang
[29].

La neurosina hidroliza PAR 1 y 2 en una secuencia de su extremo amino
terminal [19] produciendo su activación o inactivación dependiendo del punto
exacto de corte [26].
Los PARs 1-4 se expresan ampliamente en el SNC y de forma similar a lo
que sucede con la neurosina, las mayores densidades de PAR-2 se encuentran en
hipocampo, córtex, amígdala, tálamo, hipotálamo y estriado [26] asociada en
ocasiones a áreas de neurodegeneración [30].

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La PAR2 se ha implicado en la inflamación mediante mecanismos
neurogénicos [31, 32] y contribuye a la regulación del tono vascular [32, 33]
siendo un potente mecanismo vasodilatador en las arterias cerebrales mediante la
producción endotelial de óxido nítrico [34, 35].

2.5 Implicación de la neurosina en las enfermedades neurodegenerativas
Diversos estudios han estudiado los mecanismos fisiopatológicos por los que

la neurosina podría estar implicada en algunas enfermedades neurodegenerativas:
Sinucleínpatías: La acumulación de agregados de alpha-sinucleína en el

cerebro es característica de la Enfermedad de Parkinson, la Demencia con cuerpos
de Lewy y la Atrofia multisistema. En estas enfermedades la neurosina parece
colocalizarse con la sinucleína (Figura 9) [36]. En condiciones basales la neurosina
se localiza intracelularmente en las mitocondrias y microsomas, siendo la
localización nuclear y citosólica baja. Se ha demostrado que cuando las células son
expuestas a estímulos estresantes se produce una liberación de fragmentos de
alpha-sinucleína y neurosina hacia el citosol [36]. Estudios in vitro muestran que la
neurosina previene la polimerización de esta proteína gracias a que reduce la
cantidad de monómeros y genera fragmentos con capacidad de inhibir la
polimerización [36, 37]. Mas interesante aún, otro estudio in vitro muestra que
ciertas formas mutantes y fosforiladas de la alpha-sinucleína que se expresan en la
Enfermedad de Parkinson son resistentes a la actividad de la neurosina [38].

Figura 9. Colocalización de inmunoreactividad para neurosina y alpha-sinucleína en el
cerebro de ratón en la región azonal terminal. Las flechas señalan uno de los muchos puntos
de colocalización de ambas proteínas. Bar=20 µm Tomado de Iwata [36].

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Amiloidopatías: Cuando el gen de la neurosina se coexpresa con el de la PPA
(Proteína Precursora del Amiloide) en células de la línea 293 (riñón de embrión
humano), se detectan fragmentos amiloidogénicos y las células liberan gran
cantidad de péptido Aβ truncado con disminución de los residuos 17-42 [8] (Figura
10).
Además, la neurosina es capaz de
cortar el dominio N-terminal de la PPA
en tres sitios distintos [18], por lo que
podría contribuir a la acumulación
cerebral de Aβ en la EA.

Figura 10. Detección de fragmentos
amiloidogénicos en células transfectadas con
fragmentos de cDNAs de PPA y neurosina.
Western blot: línea a, control; línea b,
neurosina; línea c, PPA 695; línea d, PPA
695 y neurosina, línea e, PPA 751 y línea f,
PPA 751 y neurosina. Tomado de Little [8].

Parece confirmado que existe
disminución de la expresión de neurosina
en las áreas parénquima cerebral con
neuropatología EA [37, 38]. De acuerdo
con los estudios de Zhang [40] la
prekalikreína6 está aumentada en el LCR
de pacientes con EA (el doble que en
controles de la misma edad), y no así en
pacientes con PD ni con Demencia por
cuerpos de Lewy, lo que podría indicar
que en la EA puede existir una alteración
de la conversión de prehk6 a hk6 [41,
42], ya que la hk6 está disminuida en
LCR [22].

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3. Justificación del tema
A la luz de lo expuesto en las páginas precedentes es evidente el beneficio
que supondría poder contar con pruebas diagnósticas que puedan asistir en el
diagnóstico de alguna de las enfermedades que causa demencia y/o predecir la
progresión de DCL a demencia.
Como marcadores bioquímicos han sido muchas las moléculas ya
estudiadas, algunas con resultados favorables (Tabla 2). Sin embargo, por diversos
motivos ninguna de ellas ha sido trasladada aún del ámbito de investigación a la
práctica clínica rutinaria. Hasta el momento actual el marcador bioquímico que
mayor utilidad ha demostrado para el diagnóstico de una enfermedad causante de
demencia es la cuantificación conjunta de proteína Aβ y proteína tau fosforilada en
LCR; que ofrece una sensibilidad y especificidad próxima al 90% para el diagnóstico
de EA. Sin embargo, la necesidad de realizar una técnica cruenta como es una
punción lumbar ha condicionado que este método no sea de uso rutinario en la
práctica clínica habitual. Otras moléculas cuantificadas en plasma u orina no
disponen de estudios completos de validación como prueba diagnóstica para el
diagnóstico diferencial de las demencias, ya que no disponen de resultados en un
número suficiente de controles y de pacientes con demencias de diverso origen.
Éste era el caso de la neurosina.
El planteamiento de este estudio parte de un escenario real, en el que el
screening de los pacientes se realiza a partir de la detección de la clínica que tienen
en común todos estos ellos: la presencia síntomas cognitivos. Es a partir de la
detección de estos síntomas cuando se plantea el problema del diagnóstico
diferencial de la enfermedad subyacente y la situación donde se percibe el vacío
actual de pruebas diagnósticas que sirvan de apoyo para lograr este objetivo.
Animados por los resultados de estudios previos, nos propusimos evaluar la
utilidad de la cuantificación plasmática de neurosina en el diagnóstico diferencial del
deterioro cognitivo. Como hemos visto, la neurosina es una proteasa de expresión
tisular, preferentemente cerebral, a la que tanto los estudios de investigación
básicos como los estudios clínicos iniciales adjudican un papel en las demencias
neurodegenerativas. De este modo otros grupos señalan diferencias en la
concentración de esta proteína en tejido cerebral, sangre y LCR de pacientes con EA
respecto a controles. En todo caso permanecían sin estudiar la variación con la
edad de la concentración plasmática de neurosina en individuos sanos, las
diferencias de concentración en las distintas entidades causantes de deterioro
cognitivo y la validez de la medición de concentración de neurosina como prueba
para la predicción evolutiva de pacientes con DCL y para el diagnóstico diferencial
de las demencias.

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Tomando como hipótesis de trabajo que la cuantificación plasmática de
neurosina podría variar entre algunas de las enfermedades causantes de demencia
investigamos de modo prospectivo la correlación entre los niveles de esta molécula
y el diagnóstico final de un grupo de pacientes con síntomas cognitivos con diversos
diagnósticos clínicos.
Los conocimientos derivados de estas investigaciones determinarán en qué
situaciones clínicas la cuantificación plasmática de neurosina puede ser de utilidad
en el diagnóstico diferencial entre entidades causantes de deterioro cognitivo y por
tanto si puede ser una variable más a añadir en los protocolos diagnósticos del
síndrome demencia.

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