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Transportador de aminoácidos heteromérico xCT: identificación, caracterización funcional y topología

by Gasol Escuer, Emma

Abstract (Summary)
RESUMEN: La familia de transportadores heteroméricos de aminoácidos posee la característica única de estar compuestos por dos subunidades: una subunidad pesada y una subunidad ligera unidas por un puente disulfuro. Mutaciones en alguno de sus miembros son responsables de aminoacidurias hereditarias, como la lisinuria con intolerancia a proteínas (LPI) o la cistinuria. Al inicio de esta tesis, nos propusimos identificar alguna nueva subunidad ligera humana de esta familia. Mediante búsqueda por homología de secuencia se clonó el cDNA correspondiente a una nueva proteína altamente homóloga a una proteína de ratón asociada al sistema de transporte xc-. La caracterización funcional confirmó que xCT humano, en combinación con 4F2hc, induce una actividad de transporte de cistina y glutamato, con sodio-independencia (sistema xc-). Los perfiles de captación de los sustratos en función del pH del medio de transporte indican que tanto el L-glutamato como la L-cistina son transportados de forma aniónica, cada uno con una carga negativa neta. Por experimentos de salida de sustrato se determinó el carácter intercambiador de este transportador, con una estequiometría de 1:1. El patrón de expresión de xCT humano por Northern blot muestra una ligera banda presente únicamente en cerebro. Experimentos de RT-PCR también resultaron positivos para los islotes pancreáticos y líneas celulares correspondientes a líneas epiteliales y tumorales, mientras riñón e hígado no mostraron ninguna señal. El papel fisiológico de xCT parece estar implicado en la captación de cistina para la síntesis de glutatión y su mantenimiento, dándole un papel relevante en situaciones de estrés oxidativo. A continuación se abordó la determinación de la topología de xCT como modelo de subunidad ligera. Experimentos de inmunodetección evidencian la localización intracelular de los dos extremos de la proteína. Utilizando la estrategia de introducir cisteínas individuales en los distintos loops y testar su accesibilidad a reactivos tiol-específicos, la topología de xCT es compatible con un modelo de 12 dominios transmembrana. Los resultados obtenidos en la zona IL2-3, con dos residuos de accesibilidad exterior (el 110 y 112) flanqueados por residuos de accesibilidad interior (el 102, 109 y 116) en un rango de 15 aminoácidos nos hacen pensar en una estructura de reentrant loop, con el residuo H110 como ápice. El hecho que estas estructuras suelen ser zonas asociadas a la ruta de paso del sustrato del transportador, nos llevó a estudiar la implicación del residuo H110. En resumen, los resultados muestran que i) la biotinilación del residuo H110C se bloquea por los sustratos y el inhibidor no transportable 4SCPG; ii) la inactivación provocada por MTSES en el transporte de h110c también es protegida por los sustratos con una IC50 similar a la Km para cada sustrato; iii) esta protección es independiente de temperatura, y por tanto no implica grandes cambios conformacionales; y iv) aunque los mutantes H110C y H110D no alteraron la Km del transportador ni su especificidad de sustrato, la sustitución por una lisina inactiva totalmente la función de xCT. Por tanto, tenemos evidencias de que H110 se encuentra cercano al lugar de unión al sustrato o ruta de paso del mismo. Estos resultados pueden encontrarse en las publicaciones siguientes: J Biol Chem (2004) vol. 279, 31228-36, J Biol Chem (2004) vol. 279, 11214-21, y Pflugers Arch. (2001) vol. 442 (2) 286-296.
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Bibliographical Information:

Advisor:Palacín Prieto, Manuel

School:Universitat de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:bioquímica i biologia molecular divisió iii

ISBN:

Date of Publication:10/21/2004

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