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Studies on the molecular mechanisms of cell proliferation: phosphatidylcholine-derived lipids and lithium modulation of the MEK/ERK pathway

by Pardo Pardo, Raül

Abstract (Summary)
Las fosfolipasas D (PLDs) son enzimas regulables que catalizan la hidrólisis de la fosfatidilcolina, un fosfofolípido mayoritario de las membranas de células eucariotas, para dar lugar a fosfatidato (PtdOH), molécula capaz de funcionar como segundo mensajero y que se ha implicado en procesos celulares como el tráfico vesicular, la reorganización del citoesqueleto y la proliferación celular. Los alcoholes primarios, como el 1-butanol, pueden derivar la formación de PtdOH por la PLD hacia la formación de los correspondientes fosfatidilalcoholes (moléculas inactivas). Es por ello que los alcoholes primarios son ampliamente usados en el estudio de las funciones celulares en las que se hayan implicados enzimas PLD. Esta tesis se centra en el estudio de procesos celulares en los que intervienen enzimas PLD, y en particular, el estudio de su implicación en el ondulamiento de la membrana plasmática (membrane ruffling) y en la proliferación celular. El ondulamiento de la membrana plasmática es un proceso dinámico que requiere del reordenamiento del citesqueleto de actina. Es fácilmente observable en células especializadas en secreción e indicativo de que la célula está exocitando activamente. Tanto mastocitos como línias celulares relacionadas responden a la estimulación por antígenos con una reorganización profunda de su citoesqueleto cortical y con la exocitosis de sus gránulos de secreción. Nosotros hemos observado que la inhibición de la formación de PtdOH por la PLD mediante la incubación con 1-butanol se traduce en la inhibición de la ondulación de la membrana plasmática en células RBL-2H3 (una línea celular mastocitaria). Dicha inhibición por 1-butanol es totalmente reversible: si se elimina el 1-butanol del medio las células recuperan la capacidad de ondular su membrana plasmática en respuesta a la estimulación por antígeno. Medidas de la actividad PLD en respuesta a antígeno indican que la ondulación de la membrana requiere de la producción continua de PtdOH por la PLD. Tanto PLD1 como PLD2 son expresadas por células RBL. En estudios de transfección con PLD1 y PLD2 marcadas con GFP (green fluorescent protein) se observa la colocalización de PLD2 en las ondulaciones de membrana de células RBL estimuladas con antígeno. Por contra, GFP-PLD1 muestra una distribución intracelular localizada en vesículas citoplasmáticas. Por ello asumimos que la isoforma PLD2 es esencial en los cambios a nivel de citoesquelto que se observan en respuesta a la estimulación por antígeno. En el estudio de la implicación de la PLD en la proliferación celular se emplearon astrocitos en cultivo como modelo celular. Se determinó la activación de la PLD en respuesta a una batería de estímulos incluyendo el promotor de tumores PMA, factores de crecimiento y agonistas de receptores metabotrópicos. Asimismo, se deteminó la estimulación de la incorporación de timidina al DNA como reflejo de la actividad mitogénica en respuesta a los mismos estímulos. Observamos una clara ausencia de correlación entre la activación de la PLD y la magitud de la respuesta mitogénica. De este dato concluimos que la formación de PtdOH por la PLD no parece ser un mecanismo comunmente implicado en la transducción de señales proliferativas. Por otra parte, la inhibición de la formación de PtdOH (por incubación en presencia de alcoholes primarios) no se traduce en la reducción de la actividad proliferativa en respuesta a diversos mitógenos, apoyando la conclusión anterior. Tras concluir que la activación de la PLD no era un requerimiento necesario en la transducción de señales mitogénicas, nos propusimos explorar mecanismos moleculares implicados en la proliferación de astrocitos. Observamos que concentraciones de litio en el rango milimolar inducen un bloqueo en el ciclo celular a nivel de G2/M en astrocitos proliferantes. Asimismo, el litio retrasa la progresión a través del ciclo celular en astrocitos deprivados de suero y estimulados por el mitógeno endotelina-1. La adición exógena de myo-inositol no es capaz de revertir los efectos del litio sobre el ciclo celular y estos no se reproducen por la inhibición selectiva de la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3). Estos resultados sugieren que los efectos del litio no son mediados ni por inhibición de inositol monofosfatasas ni por inhibición de GSK3, dos de sus dianas farmacológicas reconocidas. Por contra, el pretratamiento con litio de astrocitos proliferantes reduce la activación de ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) y de su quinasa reguladora MEK 1/2. El litio priviene también la activación de dichas quinasas en respuesta a endotelina-1 en astrocitos deprivados de suero. En células granulares de cerebelo concentraciones milimolares de litio promueven la activación de MEK y ERK. Los efectos opuestos del litio en neuronas y astrocitos nos llevan a proponer su uso terapeútico en situaciones de daño traumático en el sistema nervioso central.
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Bibliographical Information:

Advisor:Claro, Enrique; Picatoste, Fernando

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:04/10/2003

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