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Strukturuntersuchungen mit EXAFS-Spektroskopie, methodische Aspekte, Weiterentwicklung der Methode . The Metall Centres of Cytochome-c Oxidase : Structural Studies with EXAFS Spectroscopy, Methodical Aspects, Improvement of the Method

by Groppe, Jochen

Abstract (Summary)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Metallzentren der Cytochrom-c-Oxidasen (CCO) aus Thermus thermophilus (T.t.), aus Paracoccus denitrificans (P.d.) und dreier mit gentechnischen Methoden erzeugten Proteine (M227I, C216S, SU II) mit Hilfe der EXAFS-Spektroskopie untersucht. Die EXAFS-Messungen an der löslichen Domäne der Untereinheit II der CCO aus P.d. exprimiert in E. coli (SU II) ermöglichten erstmals die Untersuchung eines CuA-Zentrums mit EXAFS ohne die Überlagerung durch Signale von CuB. Das CuA-Zentrum ist ein zweikerniges Zentrum mit sehr kurzem Cu-Cu-Abstand dessen Kupfer-Atome von zwei (mü)2-Schwefel-Liganden verbrückt werden. Terminal an die beiden Cu-Atome koordiniert jeweils ein Histidin. Es kann nicht ausgeschlossen werden, daß die in verschiedenen Arbeiten als schwach koordinierend diskutierten Methionin- und Glutamat-Backbone-Liganden maskiert und damit nicht zu detektieren sind. Somit ist eine CuA-Zentrum. Am CuB koordinieren drei Histidinliganden. Der mittlere Fe-Cu-Abstand im Fea3/CuB-Zentrum beträgt 3,99 Å. Die beiden Eisenatome des Enzyms sind durch je einen Porphyrin-Ring koordiniert. Das Feb-Zentrum vervollständigt seine Koordination durch zwei axial zum Ring gebundene Histidin-Reste, das Fea3 durch einen axial gebundenen Histidin-Rest. Der Vergleich der EXAFS-Messungen an der CCO aus P.d. mit denen für die CCO aus T.t. zeigt, daß die Metallzentren der beiden Enzyme bis auf Details identisch sind. Das Kupfer-EXAFS der Mutante M227I der CCO aus P.d. zeigt eine Erhöhung der mittleren Koordinationszahl der Kupfer-Atome im mutierten CuA-Zentrum auf vier. Die daraus resultierende strukturelle Änderung bedingt eine Spin-Lokalisation im nativ Spin-delokalisierten Zentrum. Offensichtlich ist das in CCO hochkonservierte Methionin 227 erforderlich, um die einzigartige geometrische und elektronische Struktur des CuA-Zentrums zu stabilisieren. Die spektroskopischen Untersuchungen an der Mutante C216S der CCO aus P.d. zeigen statt des CuA-Zentrums ein einkerniges Kupfer-Zentrum an der Bindungsstelle des dem konservierten Methionin 227 zugewandten Kupferatoms des CuA-Zentrums. Das Zentrum wird durch ein Histidin, ein Cystein, ein Methionin und einen weiteren Liganden (S/Cl) tetraedrisch koordiniert. Es wird deutlich, daß das im CuA verbrückend koordinierende Cystein 216 essentiell zur Bildung eines homodinuklearen Zentrums ist. Ausserdem wurde eine optimierte Meßstrategie entworfen, mit der die zur Verfügung stehende Meßzeit zugunsten der kritischen Bereiche des Spektrums teilweise umverteilt wird. Es wurde eine neuartige Methode zur quantitativen Bestimmung der statistischen Qualität von EXAFS-Spektren entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode konnte ein neuartiges dynamisch-adaptives Verfahren zur Glättung von Spektren entwickelt und programmiert werden. Es wurden zusätzlich Erweiterungen zur Standardsoftware Cerius2 entwickelt. Die Erweiterungen ergänzen die Funktion und die Oberfläche des Programms.
Bibliographical Information:

Advisor:Henkel, Gerald

School:Universität Duisburg-Essen, Standort Essen

School Location:Germany

Source Type:Master's Thesis

Keywords:chemie gerhard mercator universitaet

ISBN:

Date of Publication:05/21/2001

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