Details

Structural Determiants Of Adenophostin a Activity. Proposal and Synthetic Approach to new Adenophostin a Analogues

by Benito Alifonso, David

Abstract (Summary)
RESUMENS: 1D-myo-Inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3) és un segon missatger que té un paper molt important en lactivitat dels magatzems de calci intracellulars així com en lentrada de calci al citoplasma. Estímuls extracellulars tals com hormones, neurotransmissors or factors de creixement (primers missatgers) són capaços dunir-se a receptors específics localitzats a la part exterior de la membrana cellular. Com a resultat daquesta unió té lloc lactivació de la fosfolipasa C localitzada a la membrana cellular. Aquesta, al seu torn, catalitza la hidrólisi de fosfolípids, alliberant-se diacilglicerol (DAG) i IP3 (segon missatger). Lany 1993, Takahashi i collaboradors aïllaren dun cultiu de Penicillium brevicompactum, dos potents gliconucleòtids trisfosfat: Adenofostina A i B. Aquests compostos són els agonistes més potents descrits fins ara, presentant activitats de 10 a 100 vegades superiors a les del propi IP3. Des dun punt de vista químic, les adenofostines comparteixen amb lIP3 lagrupació bisfosfat trans-diequatorial flanquejada per un grup hidroxil a la posició C-2 (veure figura). A més a més, les adenofostines són resistents als enzims que metabolitzen lIP3 com per exemple IP3-fosfatasa i IP3-quinasa. Shan sintetizat molts anàlegs de les adenofostines amb la finalitat per una banda delucidar les característiques estructurals responsables de la seva activitat i per laltra dobtenir compostos més actius. Tantmateix, fins a dia davui, solament pocs anàlegs han superat lactivitat de lIP3 i cap dells ha conseguit superar lactivitat de les adenofostines. Estudis destructura-activitat han permés dissenyar un model farmacófor per a ladenofostina A. Les principals característiques del qual són: La unitat bisfosfat trans-diequatorial flanquejada pel grup 2-OH, el qual és un punt clau en laactivitat de ladenofostina i mimetitzaria la unitat 4,5-bisfosfat-6-OH de l IP3. La presència de ladenina (o qualsevol estructura equivalent) incrementa lactivitat respecte a la de l IP3. En aquesta direcció, shan proposat dos possibles papers per a ladenina. Per una banda, ladenina podria permetre un millor posicionament de 2-fosfat mitjançant una conformació C2-endo (paper indirecte). Per laltra, ladenina podria estar implicada directament en interaccions complementàries amb una regió localitzada prop del centre dunió (paper directe) permetent daquesta manera evitar lefecte del domini inibidor C-terminal. Concretament, sha proposat lexistència duna interacció catió-??entre ladenina i un residu dargininia (Arg 504). Un estudi recent dut a terme en collaboració amb el Dr. Morère, ha mostrat que els receptors de la manosa-6-fosfat són capaços de reconéixer anàlegs de manosa que incorporen grups carboxilats isòsters. En concret, sha mostrat que els anàlegs carboxilats tenen la mateixa afinitat per receptor que la manosa-6-fosfat. A més a més, amb aquesta substitució (fosfat-carboxilat) és pot evitar la labilitat dels grups fosfat. Com sha mencionat anteriorment, les adenofostines són resistents als enzimes que metabolitzen l IP3. En aquest sentit, és ben conegut que la presència dun àtom de flúor a la posició 2 en un glicòsid incrementa lestabilitat de lenllaç glicosídic especialment davant la hidròlisi àcida. Amb aquests antecedents, es va proposar estudiar la capacitat del IP3R per reconéixer efetivament anàlegs dadenofostina en els quals un o més grups fosfats han estat reemplaçats per unitats metilencarboxilat. Daltra banda, també es va proposar incrementar lestabilitat de ladenofostina mitjançant la introducció dun àtom de fluor a la posició C-2. Daquesta manera, el present treball sha centrat en dos punts principals: El primer és confirmar les interaccions de ladenina amb el receptor i el paper del fosfat 2 en lactivitat de ladenofostina. En aquest sentit, sha dut a terme levaluació biològica de: IP3, adenofostina A, inositol 4,5-bisfosfate (IP2), and 2-defosfo-adenophostina A. Els primers assaigs es van dur a terme utilitzant el receptor en la seva forma completa, el fragment corresponent al domini dunió i aquest mateix fragment incorporant una mutació a la posició 568 (Arg a Gln). Aquest residu interacciona amb el fosfat 1 de lIP3 i es creu que interaccionaria també amb el fosfat 2 de ladenofostina. Els següents assajos es van realitzar utilitzant el mateix fragment anteriorment citat, però aquest cop incorporant una mutació a la posició 504 (Arg a Gln). Es creu que aquest residu podria formar una interacció tipus catió-? stacking amb ladenina. Del resultat daquestes evaluacions biològiques, es pot deduir que lactivitat de ladenofostina es deguda principalment a la presència de ladenina i, a més a més, la suposada òptima disposició del fosfat 2 no es determinant per a lelevada afinitat de ladenofostina. També sha confirmat la presència de la intercció catió-? al centre dunió del receptor. El segon punt de lestudi presentat ha estat el disseny i la síntesi de nous anàlegs dadenofostina basats en els resultats dels estudis biològics anteriorment mencionats. Així doncs, sha sintetitzat el precursor dun anàleg dadenofostina que incorpora un àtom de flúor a la posició C-2 amb la finalitat de conferir-li major estabilitat a lenllaç glicosídic i evaluar el paper del grup 2-OH en la formació de ponts dhidrogen. La introducció del flúor a lestructura de ladenofostina es va dur a terme mitjançant la fluoració electròfila del 3,4,6-tri-O-acetyl-D-glucal amb Selectfluor®. El qual, posteriorment, es va convertir en el corresponent bromur de glicosil. Per altra banda, ladenosina va ser convenientment protegida i utilitzada com a acceptor de glicosil amb el fragment fluorat. Els següents passos posteriors a la glicosilació foren la manipulació de grups protectors amb la finalitat dobtenir el substrat apropiat par a la introducció dels grups fosfat a les posicions desitjades (2, 3, 4). Així també, considerant el paper secundari del fosfat 2 en lactivitat de ladenofostina, ens vam centrar en la síntesi de dos nous anàlegs en els quals els grups fosfat de les posicions 3 i 4 van ser substituits per un grup metilencarboxilat. Així, a banda dincorporar funcionalitats no metabolitzables, la substitució alternada permetria saber el paper de cadascún dels fosfats en la unió amb el receptor. Lestructura bàsica per als dos anàlegs es va obtenir de la glicosilació de ladenosina convenientment protegida amb un tioglicosid que incorporava la unitat metilencarboxilat en la seva estructura. El methyl (4,6-O-benzilidene)-1-O-?-glucòsid va ser el matrial de partida per a la síntesi dels dos fragments de carbohidrat, els quals es van obtenir variant la seqüència de grups protectors utilitzada. La introducció del precursor de la unitat metilencarboxilat a les unitats de carbohidrat es va fer mitjançant allilació radicalària, obtenint-se els allil derivats amb la estereoquímica desitjada. La posterior ruptura oxidativa del grup allil donà lloc a làcid. Les etapes finals de la síntesi dels fragments de carbohidrat implicaven la hidròlisi de la posició anomèrica i la formació del tioglicòsid. Finalment, els tioglicòsids així obtinguts es van fer reacionar amb el derivat dadenosina obtenint-se lestructura bàsica per tots dos anàlegs. Després de vàries etapes de desprotecció, es van obtenir els substrats apropiats per a la fosforilació. En resum, el present treball ha permès: 1. Establir les característiques estructurals que confereixen a les adenofostines la seva elevada activitat, fins i tot superior a la del propi IP3. 2. Sintetitzar els precursors de tres nous anàlegs dadenofostina els quals presenten modificacions estructurals que haurien de permetre: a) saber el paper independent de cadascún dels fosfats en el producte natural; i b) saber el paper del grup 2-OH en les interaccions amb el receptor. ENGLISH During the past decades, much progress has been made in the knowlledge of calcium signalling and how cells employ calcium in order to regulate their processes. 1D-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) is a second messenger that plays an important role in intracellular calcium stores activity as well as in extracellular calcium entry. Extracellular stimuli such as hormones, neurotransmitters or growing factors (first messengers) are capable to bind to specific receptors located a the outer face of cell membrane. This bind results in an activation of Phospholipase C located on the cell membrane, which in turn catalyses the hydrolysis of phospholipids, releasing diacyl-glycerol (DAG) and IP3 (second messenger). In 1993, Takahashi et al. isolated from a Penicillium brevicompactum, culture, two potent glyconucleotides trisphosphate: Adenophostin A and B. These compounds are the most potent IP3 agonists ever reported until now, being from 10 to 100 fold times more active than IP3 itself. From a chemical point of view, Adenophostins share with IP3 a trans-diequatorial bis-phosphate moiety flanked by an hydroxyl group at C-2.(see Figure) Moreover, Adenophostins are resistent to enzymes that metabolize IP3 such as IP3-phosphatase and IP3-kinase. Many Adenophostin analogues have been synthesized in order to elucidate strucural features responsible of Adenophostin activity, and to obtain more active compounds. However, until now, only few analogues has overcome IP3 activity and none of them has reach Adenophostine activity. Structure-activity-relationship studies has allowed to design a pharmacophore model for Adenophostin A. Main features of this model are: The trans-diequatorial bis-phosphate moiety flanked by 2-OH, which is a key point for Adenophostin biological activity, and mimics 4,5-bisphosphate-6-hydroxyl groups in IP3. The presence of adenine (or any equivalent structure) increases its activity respect to IP3. In that direction to possible adenine roles have been proposed. Adenine would allow to position 2-phosphate in an optimal disposition through a C2-endo conformation (indirect role). On the other hand, adenine could be directly involved in complementary interactions with a region located near the binding site (direct role) allowing to avoid the effect of C-terminal inhibitory domain. In particular, it is proposed the existence of a cation-? interaction between adenine ring and an arginine residue (Arg504). A recent study carried out in collaboration with Dr. Morère, has allow to show that that mannose-6-phosphate receptors are capable of recognize mannose analogues incorporating carboxylate isoster groups. In particular, it has been showed that carboxyl analogues have same affinity for the receptor as mannose-6-phosphate. Moreover, with this substitution (phosphate-carboxylate) lability of phosphate groups can be avoided. As has been mencioned before, Adenophostins are resistent to IP3 metabolizing enzymes. In that direction, it is well known that the presence of a fluorine atom at 2 position of glycosides increases glycosidic bond stability specially towards acidic hydrolysis. With this background in mind, it was proposed to study whether IP3R are capable of recongnising effectively Adenophostin analogues in which one or more phosphate groups have been replaced by methylene carboxylate moieties. On the other hand, it was also proposed to increase Adenophostin stability by means of fluorine introduction at position C-2. Present work has been focused in two points: The first one was focused in confirming the interactions of adenine with the receptor and the role of 2-phosphate in Adenophostin activity. In this sense, biological avaluation of IP3, Adenophostin A, inositol 4,5-bisphosphate (IP2), and 2-dephospho-Adenophostin A has been carried out. First assays were made with using full lenght receptor, binding domain fragment and binding domain fragment incorporating a mutation at position 568 (from Arg to Gln). This residue interacts with phosphate 1 of IP3 and it is supposed to interact with Adenophostin 2-phosphate as well. Second assays were made using binding domain receptor fragment incorporating a mutation at position 504 (from Arg to Gln). This residue it is supposed to form a cation-? stacking with adenine moiety. With this biological avaluations, it can be deduced that Adenophostin A activity is mainly due to the adenine presence, and moreover, the supposed optimal 2-phosphate disposition is not determinant in Adenophostin high affinity. Furthermore, it has been confirmed the presence of cation-? stacking interaction at the binding core. The second point of the present work has been the design and synthesis of new Adenophostin analogues based in biological study results and antecendents mentioned above. Thus, it has been synthesized the precursor of an Adenophostin analogue incorporatin a fluorine atom at C-2 in order to confer more stability to the glycosydic bond and avaluate the role of 2-OH in hydrogen bonding. The introduction of fluorine into Adenophostin structure was carried out by means of electrophilic fluorination with Selectfluor® of 3,4,6-tri-O-acetyl-D-glucal, which lately was transformed into the corresponding glycosyl bromide. On the other hand, adenosine was conveniently protected and used as glycosyl acceptor in the glycosylation with fluorinated building block. Next steps after glycosylation were protecting group manipulation in order to afford a suitable substrate for phosphate group introduction at desired positions (2, 3, 4). Furthermore, considering the secundary role of 2-phosphate in Adenophostin activity, we focused in the synthesis of two Adenophostin analogues in which phosphate groups at position 3 and 4 were replaced by a methylenecarboxylate moiety. Thus, a part from incorporate non metabolizable groups, alternate substitution would allow to know the independent role of each phosphate in receptor binding. Basic structure for two analogues was afforded from the glycosylation of conveniently protected adenosine with a thioglycoside derivative incorporating the methylenecarboxylate moiety in its structure. Methyl (4,6-O-benzylidene)-1-O-?-glucoside was used as starting material for both carbohydrate fragments, which were afforded depending on the protecting groups sequence used. Introduction of methylencarboxylate precursor into the scaffolds was made via radical allylation, affording allylderivatives with desired stereochemistry. The acid was obtained upon oxidative cleavage of allyl group. Lasts steps of the carbohydrate fragment synthesis involved the hydrolysis of anomeric position and thioglycoside synthesis. Finally, thioglycoside obtained was reacted with adenosine derivative affording the basic structure for both analogues. After several deprotection steps, apropiate substrates for phosphorilation at desired positions were afforded. In summary, the present work has allowed to: 1. Stablish the structural features that confere to Adenophostins a activity higher than IP3. 2. Synthesize three precursors of Adenophostin analogues presenting new structural modifications that would allow to a) know the independet role of each phosphate in the natural product and b) the role of 2-OH in receptor interaction.
This document abstract is also available in .
Bibliographical Information:

Advisor:Matheu Malpartida, Ma. Isabel

School:Universitat Rovira i Virgili

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:departament de química analítica i orgànica

ISBN:

Date of Publication:03/28/2008

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.