Details

Procarboxipeptidases humanes: estudis funcionals i estructurals de formes pancreàtiques i de noves formes reguladores

by Segura Martín, Sonia

Abstract (Summary)
L´estudi portat a terme en la tesi doctoral tracta sobre la relació estructura/funció de metalülocarboxipeptidases humanes, també anomenades carboxipeptidases (CPs). El treball realitzat s´ha dividit en dues parts diferenciades: una primera centrada en estudis funcionals i una segona part que conté estudis estructurals. Algunes CPs se sintetitzen en forma inactiva: les procarboxipeptidases (PCPs), les quals presenten segments d´activació d´una longitud de 91-96 residus, els quals han d´ésser separats del domini enzimàtic mitjançant un atac proteolític per part d´una proteasa activant. En la primera part d´aquest treball, l´optimització de sistemes d´expressió heteròloga i purificació per a la PCPA1 i PCPB humanes ha permès l´obtenció de quantitats suficients de proteïna per a realitzar un estudi detallat dels seus mecanismes d´activació. Així mateix, s´ha aplicat el mateix sistema d´expressió i purificació al mutant D255K de la PCPB humana. En contrast amb el que s´havia determinat per a la PCPA1 porcina, la PCPA1 humana presenta un mecanisme d´activació més semblant al de les formes B i A2: calen unes condicions d´activació suaus i se segueix una cinètica d´activació monotònica, en què el segment pro del proenzim no presenta activitat inhibidora sobre la carboxipeptidasa generada, essent el tall tríptic primari suficient per alliberar-lo de l´enzim. L´estudi comparatiu dels processos d´activació de la PCPB humana tipus salvatge i del seu mutant amb especificitat reversa D255K demostra la participació de la CPB en el processament del seu segment pro. D´altra banda, la generació d´una nova diana tríptica sobre Arg93A durant el procés d´activació del mutant pot indicar que la introducció de la mutació provoca una distorsió de les interaccions entre el segment pro i el domini enzimàtic. La segona part del treball es centra en estudis estructurals. D´una banda, s´ha resolt l´estructura de la PCPB humana, la qual és molt semblant a la d´altres PCPs prèviament estudiades i s´observa que la zona més variable és la regió de connexió entre el domini d´activació globular i el domini enzimàtic. Pel que fa a l´arquitectura del centre actiu, s´observen conformacions alternatives en certs residus del centre actiu. La resolució de l´estructura tridimensional de la PCPB humana, junt amb la d´altres estructures de PCPs prèviament obtingudes, ha permès l´obtenció d´un model acurat de la TAFI, un proenzim d´elevada rellevància biomèdica. L´estudi d´aquest model i l´anàlisi del seu perfil d´energia pseudopotencial permet l´elaboració d´una hipòtesi per explicar la inestabilitat conformacional intrínseca de la seva forma activa. D´altra banda, s´han modelat les estructures de tres nous membres de la família de les metalülocarboxipeptidases, els quals han estat identificats mitjançant cerques en la base de dades del genoma humà. D´acord amb la predicció de les seves especificitats els enzims s´han anomenat CPA5, CPA6 i CPO. La PCPA5 presenta major similülitud amb la PCPA1 i PCPA2 pancreàtiques. L´anàlisi de la butxaca d´especificitat indica que la l´enzim actiu mostra especificitat tipus A, amb una possible preferència per a residus C-terminals alifàtics petits. El model de la PCPA6 presenta una estructura més semblant a la PCPB, però l´especificitat predita per a l´enzim actiu és de tipus A. Les substitucions en la seva butxaca d´especificitat indiquen que la CPA6 podria presentar major eficiència en el processament de residus C-terminals hidrofòbics grans. Per a la CPO només s´ha modelat el domini enzimàtic, ja que els possibles exons codificants de la regió N-terminal no van poder ser identificats. La CPO presenta una estructura semblant a la de la CPB, però una sèrie de substitucions en la seva butxaca especificitat indiquen que presenta una nova especificitat no descrita fins ara per a residus C-terminals àcids.
This document abstract is also available in English.
Bibliographical Information:

Advisor:Avilés Puigvert, Francesc Xavier; Vendrell Roca, Josep

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:12/13/2002

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.