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Plegamiento y funcionalidad biológica del inhibidor de metalocarboxipeptidasas LCI

by Salamanca Seguí, Sílvia

Abstract (Summary)
En el primer trabajo de esta tesis se dilucida el camino de plegamiento oxidativo del LCI. El LCI reducido y desnaturalizado se repliega a través de un flujo secuencial y rápido de intermediarios de uno y dos puentes disulfuro, y llega a una etapa limitante en la cual la mezcla de tres especies mayoritarias que contienen 3 puentes disulfuro y una población heterogénea de isómeros de cuatro puentes disulfuro no nativos (scrambled) coexisten. Los intermediarios de tres puentes disulfuro se han identificado como trampas cinéticas que se hallan a lo largo del camino de plegamiento del LCI, y se han caracterizado sus estructuras: dos de ellos contienen sólo puentes disulfuro nativos. El camino de plegamiento del LCI comprende propiedades exhibidas tanto por el BPTI como por la hirudina, dos modelos divergentes con características de plegamiento opuestas. Los resultados obtenidos en el estudio de las vías de plegamiento del LCI confirman el enorme espectro de diversidad de los caminos de plegamiento de las proteínas. En el segundo trabajo de esta tesis se dilucidan las curvas de desplegamiento y desnaturalización del LCI. En presencia de un agente iniciador de la formación de tioles y un agente desnaturalizante se despliega el LCI nativo por el intercambio de sus puentes disulfuro, y la molécula se transforma en una mezcla de especies scrambled. Podemos distinguir claramente y aislar, entre los 104 posibles isómeros scrambled del LCI, a nueve de ellos que representan el 90% del total del LCI desplegado. La concentración de tiocianato de guanidinio e hidrocloruro de guanidinio requeridas para alcanzar el 50% de la desnaturalización son de 2,4 y 3,6 M, respectivamente. El LCI nativo es resistente a la desnaturalización por urea, incluso a concentraciones elevadas (8M). El camino de desplegamiento del LCI se ha podido definir en base a la evolución de la concentración relativa de los isómeros scrambled de la molécula a lo largo de su desnaturalización. Existen dos poblaciones de especies scrambled que sufren variaciones a lo largo del camino de desplegamiento. Una población se acumula como intermediarios bajo condiciones desnaturalizantes fuertes (incluye al isómero denominado beads-form). La otra población muestra una correlación inversa entre su abundancia relativa y las condiciones desnaturalizantes y debería poseer otro tipo de estructuras no nativas. Los resultados que se presentan en el segundo trabajo muestran que el LCI, una molécula con potenciales aplicaciones biotecnológicas, tiene cinéticas bajas de desplegamiento y es altamente estable. En el tercer trabajo de esta tesis se estudia el efecto del LCI en la fibrinólisis in vitro. Se ha descrito, tanto por estudios in vitro como in vivo, que el PCI (potato carboxypeptidase inhibitor) incrementa la tasa de lisis de los coágulos de fibrina. Con este mismo propósito, hemos evaluado y comparado la capacidad profibrinolítica del LCI con la del PCI. Todos los resultados han sido obtenidos en ensayos con plasma humano, en un sistema in vitro. Hemos demostrado que ambos inhibidores, el LCI y el PCI, aceleran de forma substancial la lisis de los coágulos tratados con t-PA, esta aceleración es dependiente de la concentración de inhibidor. El LCI se ha mostrado unas 10 veces más potente que el PCI como acelerador de la fibrinólisis, y también muestra una mayor capacidad inhibidora de TAFI al realizar ensayos de actividad enzimática en plasma. Se ha estudiado el posible efecto de estos dos inhibidores sobre la estructura del coágulo de fibrina mediante microscopía electrónica de transmisión y de barrido. Se ha observado un incremento significativo en el grosor de las fibras y una disminución simultánea en la densidad de su entrecruzamiento: el LCI puede tener una aplicación en las terapias trombolíticas basadas en t-PA.
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Bibliographical Information:

Advisor:Lorenzo, Jullia; Vendrell, Josep

School:Universitat Autónoma de Barcelona

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:406 departament de bioquimica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:06/26/2003

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