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Oligonucleotide Based-Biosensors for Label-Free Electrochemical Protein and DNA Detection.

by Mir Llorente, Mònica

Abstract (Summary)
BIOSENSORS ELECTROQUÍMICS BASATS EN OLIGONUCLEÒTIDS PER LA DETECCIÓ DADN I PROTEINES SENSE MARCATGE PREVI En els últims anys, els xips dADN han atret una atenció creixen en els camps de la diagnosis mèdica i la química analítica, degut a la seva portabilitat, sensibilitat, especificitat, ràpida resposta i lampli ventall daplicacions. Els xips dADN són rellevants per la diagnosis de malalties genètiques, detecció dagents infecciosos, estudis de predisposició genètica, desenvolupament de medicina personalitzada, detecció dexpressió genètica diferencial, medicina forense, exploració de medicaments, seguretat alimentaria, defensa militar i monitorització mediambiental. Encara que els xips basats en oligonucleòtids per la detecció dADN i proteïnes siguin una gran promesa en medicina i recerca biològica, aquesta tecnologia es encara molt lluny del seu ús diari en el camp clínic i encara més lluny de poder ser comercialitzada per ús domèstic com ho han estat el biosensors de glucosa. Els seus principals problemes són el seu alt cost i la seva dificultat dús. Ja que per la seva utilització és necessari, previ a la injecció de lanalit en el biosensor, costosos instruments de laboratori i tècnics especialitzats en bioquímica pel marcatge i amplificació de les mostres dADN. En canvi els requeriments que un biosensor ha dincloure són, ser fàcil dutilitzar, per tant que lanalit no necessiti un marcatge previ i laddició de reactius per la seva detecció. Aquest ha de donar una resposta ràpida i sensible a baix cost i ha de permetre la detecció en el mateix equip de diferent tipus danalits. El treball fet en aquesta tesis descriu el desenvolupament de nous concepte de plataformes biosensòriques electroquímiques basades en oligonucleòtids per la detecció dADN i proteïnes no marcades prèviament, els quals inclouen aquest requeriments. Experiments preliminars per la detecció de lhibridació dADN marcat es van portar a fi per tal destablir un protocol per la immobilització, hibridació i detecció dADN colorimètricament i electroquímicament. És van utilitzar mostres reals dADN i sistemes de detecció de multi-analits en un xip desenvolupat per fotolitografia biocompatible. Per tal de no necessitar un marcatge previ de la mostres dADN i així simplificar i reduir el cost del futur biosensor es va desenvolupar un sistema electroquímic de desplaçament. El mètode lliure de marcatge es basa en el desplaçament de molècules doligonucleòtid mutat i marcat, els quals encara que continguin certes mutacions són capaços dhibridar amb la sonda doligonucleòtid immobilitzat, però quan aquestes es troben en presència de lanalit desplaça la molècula mutada i marcada, disminuint així la senyal de manera proporcional en la concentració del analit. El sistema de desplaçament ha estat demostrat colorimètricament i electroquímicament utilitzant un marcatge dHRP sobre el mutat i utilitzant un marcatge de ferrocè en loligonucleòtid mutat per tal de no necessitar afegir cap reactiu per la detecció de lanalit, També es van portar a fi diferents estratègies per desenvolupar un biosensor electroquímic basat en oligonucleòtids (aptamers) per la detecció de la proteïna trombina sense el previ marcatge daquest analit i sense necessitat dafegir reactius per la detecció del analit. En el sistema mes sensible es va obtenir un límit de detecció de 30 fM en un temps de resposta de sols 5 minuts. BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS BASADOS EN OLIGONUCLEOTIDOS PARA LA DETECCIÓN DE ADN Y PROTEINAS SIN UN MARCAJE PREVIO En los últimos años, los chips de ADN han atraído una atención creciente diferentes campos, debido a su portabilidad, sensibilidad, especificidad y rápida respuesta. Los chips de ADN son aplicados en diagnosis de enfermedades genéticas, detección de agentes infecciosos, estudios de predisposición genética, desarrollo de medicina personalizada, detección de expresión genética diferencial, medicina forense, exploración de medicamentos, columnas de separación, seguridad alimentaría, defensa militar y monitorización medioambiental. Aunque los chips basados en oligonucleótidos para la detección de ADN y proteínas tienen un gran futuro en diagnosis e investigación biológica, esta tecnología está aun muy lejos de su uso diario en el campo clínico y aun mas lejos de poder ser comercializado para uso doméstico como lo han sido los biosensores de glucosa. Sus principales problemas son su alto coste y su dificultad de uso. Para su utilización es necesario, previo a la inyección del analito en el biosensor, costosos instrumentos de laboratorio y técnicos especializados en bioquímica para el marcaje y amplificación de las muestras de ADN. En cambio los requerimientos que un biosensor ha de incluir son, ser fácil de utilizar, por tanto el analito no ha de necesitar un marcaje previo ni la adición de reactivos para su detección. Este ha de dar una respuesta rápida y sensible a bajo coste y ha de permitir la detección en el mismo equipo de diferentes analitos. El trabajo hecho en esta tesis describe el desarrollo de nuevos conceptos de plataformas biosensóricas electroquímicas basadas en oligonucleótidos para la detección de ADN y proteínas no marcadas previamente, los cuales incluyen estos requerimientos. Experimentos preliminares para la detección directa de la hibridación de ADN marcado se llevó a cabo para establecer protocolos para la inmovilización, hibridación y detección de ADN colorimétricamente y electroquímicamente. Se utilizaron muestras reales y sistemas de detección de multi-analitos en un chip desarrollado por fotolitografía biocompatible. Para no necesitar un marcaje previo de la muestra de ADN y así simplificar y reducir el coste del futuro biosensor se desarrolló un sistema electroquímico de desplazamiento. El método libre de marcaje se basa en el desplazamiento de moléculas de oligonucleótido mutado y marcado, el cual aunque contenga ciertas mutaciones es capaz de hibridar con la sonda de oligonucleótido inmovilizado, pero cuando estas se encuentran en presencia del analito desplaza la molécula mutada, disminuyendo así la señal de manera proporcional a la concentración del analito. El sistema de desplazamiento ha sido demostrado colorimétricamente y electroquímicamente utilizando marcaje de HRP sobre el mutado, así como un marcaje de ferroceno que no requiere la adición de reactivos para su detección. También se llevaron a cabo diferentes estrategias para desarrollar un biosensor electroquímico basado en oligonucleótidos (aptámeros) para la detección de trombina sin el previo marcaje de este analito, ni la adición de reactivos para la detección del analito. En el sistema más sensible se obtuvo un límite de detección de 30 fM en un tiempo de respuesta de solo 5 minutos
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Bibliographical Information:

Advisor:Katakis, Ioannis

School:Universitat Rovira i Virgili

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:departament d enginyeria química

ISBN:

Date of Publication:11/24/2006

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