Modulation of hepatic lipoprotein metabolism by dietary procyanidins

by del Bas Prior, Josep Maria

MODULATION OF HEPATIC LIPOPROTEIN METABOLISM BY DIETARY PROCYANIDINS PhD Thesis Josep Mdel Bas INTRODUCTION During the past decade, Nutrition research has been subjected to a shift of focus, from epidemiology and physiology to the comprensión of the molecular basis of nutrients actions. Thus, the new -omics disciplines transcriptomics, proteomics or metabolomics, provide the tools to understand the molecular mechanisms involved in the modulation of gene expression by nutrients. The study of the beneficial properties of wine procyanidins has not avoided this shift of focus. Thus, from the initial studies which defined the French paradox, to nowadays, a wide array of studies have been focused in defining the properties of the non-alcoholic components of red wine, mainly flavonoids, a family of polyphenolic compounds. The objectives of this thesis have been to define the molecular mechanisms by which grape procyanidins modulate the hepatic metabolism of lipoproteins, reducing the risk of cardiovascular disease and other pathologies which basis is found in the dysregulation of the lipoprotein metabolism. SUMMARY In the present thesis, the effect of procyanidins in the hepatic lipoprotein metabolism has been studied. With this objective, HepG2, HeLa and CV-1 cells have been used as invitro models. In vivo studies have been performed in Wistar rats and C57BL6 mice, wild-type and transgenic mice lacking SHP (NR0B2) and FXR (NR5H1). RESULTS 1. Procyanidins improve plasma lipid profile in the postprandial phase in rats. A single oral dose of procyanidins decreases plasma triglycerides and ApoB levels to 50% of control values. In addition LDL-Cholesterol is significantly reduced, thus improving the atherosclerotic risk index. 2. Procyanidins display a triglyceride-lowering effect both in vivo and in vitro. In rat and mouse, procyanidin treatment triggers a hypotriglyceridemic response. In HepG2 cultures, procyanidins down-regulate the secretion of triglycerides and ApoB, thus showing that these flavonoids act directly on hepatic cells. This fact strongly suggests that, in vivo, a direct action of procyanidins on the liver contributes to their hypotriglyceridemic response. 3. Nuclear receptor Small Heterodimer Partner (SHP) is a target of procyanidins in hepatic cells. Procyanidins modulate the expression of SHP, rapidly increasing its expression in rat liver as well as in HepG2 cultured cells. 4. SHP mediates the triglyceride-lowering activity of procyanidins in vitro and in vivo. When SHP expression is silenced in HepG2 or abolished in SHP-null mice, procyanidins lose their hypotriglyceridemic activity. In contrast, in SHP-silenced HepG2 cells, procyanidins are still able to reduce apoB secretion. Hence, procyanidins reduce triglyceride via a SHP-dependent mechanism, whereas they reduce apoB in a SHPindependent manner. 5. Nuclear receptor Farnesoid X Receptor (FXR) is an essential mediator of the hypotriglyceridemic action of procyanidins upstream SHP. Oral gavage of procyanidins to FXR-null mice have not a hypotriglyceridemic effect. Moreover, luciferase based in vitro assays showed that procyanidins increase the transcriptional activity of FXR. Thus, FXR is an essential component of the signalling pathway used by procyanidins to elicit the triglyceride lowering effect. 6. Key genes of the inflammation process are targets of procyanidins in liver, in the postprandial phase. Oral administration of procyanidins to rats rapidly downregulates the expression, in liver, of transcription factor Egr1, a mediator of the hepatic inflammatory response, and several acute-phase proteins, namely haptoglobin, fibrinogen B and alpha-1 antitrypsin. In addition, expression of DUSP6, a component of the ERK1/2 subfamily of MAPK, is repressed by this treatment. Nfkbia, a repressor of NF-kB activity, is overexpressed upon procyanidin treatment. This expression pattern strongly suggests that procyanidins attenuate the pro-inflammatory state associated to the postprandial phase. MODULATION OF HEPATIC LIPOPROTEIN METABOLISM BY DIETARY PROCYANIDINS PhD Thesis Josep Mdel Bas INTRODUCCIÓN Durante la pasada década, la investigación en nutrición se ha visto sujeta a un cambio en sus objetivos, pasando de los estudios basados en la fisiología y la epidemiología a la comprensión de las bases moleculares implicadas en las acciones biológicas de los nutrientes. Así, las nuevas disciplinas, como la biología molecular o las -omics, transcriptómica, proteómica o metabolómica, proporcionan las herramientas para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la modulación génica por nutrientes. El estudio de las propiedades beneficiosas del vino no ha evitado este cambio de foco. Así, desde los primeros estudios que definieron la paradoja francesa, hasta la actualidad, una ámplia gama de estudios se han dedicado a definir las propiedades de los componentes no alcohólicos del vino, mayoritariamente, los Flavonoides, una familia de compuetos polifenólicos. El objetivo de esta tesis ha sido definir los mecanismos moleculares mediante los cuales las procianidinas de uva modulan el metabolismo de lipoproteínas en el hígado, disminuyendo así el riesgo cardiovascular y diferentes patologías cuya base se encuentra en la desregulación del metabolismo lipoproteico. MEMORIA Durante esta tesis se ha estudiado el efecto de las procianidinas sobre el metabolismo lipoproteico en el hígado. Con este objetivo se han usado líneas celulares como modelo in vitro, tanto hepatocitos (HepG2) como líneas accesorias (HeLa y CV-1). Como modelos para el estudio de las procianidinas in vivo se han usado ratas de la cepa Wistar y ratones de la cepa C57BL6, tanto wild-type como dos líneas de transgénicos, Knockout para SHP (NR0B2) y FXR (NR5H1). RESULTADOS Se han obtenido los siguientes resultados: Las procianidinas de uva disminuyen los niveles de lipoproteínas ricas en triglicéridos, así como mejoran los índices de riesgo cardiovascular en ratas. Estos efectos se deben a la modulación de la expresión génica en el hígado, tejido adiposo y músculo entre otras acciones. El mecanismo por el cual las procianidinas disminuyen las lipoproteínas ricas en triglicéridos ha sido estudiado in Vitro (HepG2) e in vivo (C57BL6 wild-type y knockout para SHP). Se han definido dos mecanismos principales. El primero implica la señalización de las procianidinas por una vía dependiente de SHP (Small heterodimer partner, NR0B2), un receptor nuclear. El segundo mecanismo es independiente de SHP e inhibe la expresión de MTP (enzima controlador de la síntesis de lipoproteínas) y consecuente secreción de un menor número de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Por encima de SHP, se ha definido FXR (Farnesoid X receptor) como sensor de las procianidinas mediante el uso de ratones C57BL6 KO para FXR y sistemas reporter basados en luciferasa. Estableciendo que el mecanismo de señalización de las procianidinas pasa por FXR, que a su vez induce la expresión de SHP y este inhibe la expresión de SREBP1, factor de transcripción clave para la síntesis de lípidos, disminuyendo así la cantidad de lípidos hepáticos y, consecuentemente, la secreción de lipoproteínas. DISCUSIÓN La modulación del metabolismo de lipoproteínas es el principal objetivo para el tratamiento de las diferentes patologías relacionadas con dislipemias. Así, la definición de las procianidinas de uva como agentes hipolipidémicos, las convierte en un componente de la dieta de alta importancia para prevenir y mejorar una ámplia gama de patologías, desde la aterogénesis hasta otros estados metabólicos alterados, causantes de la resistencia a la insulina o el síndrome metabólico. Por otro lado, el establecimiento de los mecanismos moleculares implicados en los efectos de las procianidinas de uva, aumenta el conocimiento sobre estos compuestos, así como su aplicabilidad en diferentes estados metabólicos alterados. De esta manera, se ha propuesto que la activación de FXR podría usarse como una estrategia en el tratamiento de la hiperlipidemia o la resistencia a la insulina. Así, las procianidinas emergen como un importante agente terapéutico, cuya importancia radica en la amplia presencia de estos compuestos en la dieta.