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Micropropagation and determination of the in vitro stability of Annona cherimola Mill. and Annona muricata L.

by Bridg, Hannia

Abstract (Summary)
A. cherimola and A. muricata are semideciduous native trees from the tropical highlands of South America and tropical areas of the Caribbean Islands. Both have developed a commercial promise in the fruit trade market, because of their edible fruits and phytochemical products. The knowledge of these fruit trees has been scattered thus, exploration, collection, conservation and evaluation of A. cherimola and A. muricata natural genotypes is a priority in Colombia, Peru, Ecuador, Venezuela and El Salvador, countries where they are believed to be part of the native Flora. Furthermore, the promotion of technical plantations with healthy and high quality trees are the principal worldwide aims for these species. If a selected genotype of A. cherimola and A. muricata is propagated by seeds a high genotype variation is expected, when conventional vegetative propagation methods are applied, the dichogamous protogyneous flower behaviour promotes an intervarietal crossing. Therefore the conservation of selected ecotypes by the application of conventional propagation methods has been until now impossible, in those regions where they have been introduced because of their qualities such as Spain, Australia, Asia, California and Chile. The aim of the present study was to review the botanical and cultural aspects of A. cherimola and A. muricata and develop a reproducible micropropagation protocol preserving the genetic stability of the selections or promote true-to-types genotypes in order to open an alternative for this plant species. Preformed axillary bud sprouting excised from the side branches of four year old plants have been developed with a yield of 4 new shoots per bud in 20 days. The position of the buds on the branches had an effect on the bud break and establishment of cultures under in vitro conditions, therefore semiwoody cuttings with three buds were the most suitable explants for multiple shoot proliferation when cultured on a Nitsch and Nitsch (1969) medium containing 8.87 (M of benzylaminopurine and 2.46 (M of indole-butiric acid. The effect of Benomyl, Rifampicin and some antioxidants like Polyvinylpirrolydone, ascorbic acid and citric acid are discussed. There were no significant differences during the establishment of A. cherimola and A. muricata in terms of in vitro requirements, time and yield of bud new shoots formation. To improve shoot proliferation and multiplication the effect of benzylaminopurine, kinetin, zeatin and thidiazuron were compared. The NN-69 media supplemented with 2.32 (M kinetin and 1.36 (M zeatin was the proliferant for A. cherimola. A. muricata, it showed no shoot proliferantion but elongated well in 1.44 (M Gibberellic acid. Both species improved the formation of eight new shoots in 60 days of culture with one subculture after 30 days. A. cherimola and A. muricata multiplied shoots lost their quality and started to be chlorotic in relation to the number of subcultures on the same multiplication media. The variation of ammonium nitrate, potassium nitrate and ammonium carbonate supplied as salts on the Nitsch and Nitsch (1969) media were evaluated as well as the supplementation of casein hydrolisate and coconut water. The supplementation of 20.6 mM NH4- and 39.4 mM NO3- improved the promotion of quality and green shoots available for rooting. The indole-3-butiric acid 4.90 (M promotes rhizogenesis under in vitro and ex vitro conditions in both cases a previous precondition of the shoots was required. To improve in vitro rooting the concentration of Nitsch and Nitsch (1969) macro-salts should be reduced to 1/4 with a supplementation of 1 % of sucrose and 3% gelrite. The ex vitro rooting is succesfully in quartz-sand substract without plant growth regulators and 90% of relative humidity. Pattern band comparison by Random Amplified Polymorphic DNA markers was applied to determine the genetic stability of micropropagated shoots of A. cherimola and A. muricata 4 Colombian and 2 Chile selections. 29 primers were screened, of them 5 primes gave clear reproducible bands. No variation in RAPD banding patterns among the tested shoots. These results verify the genetic stability of the in vitro regenerants and tested the true-to-type propagation.

Resumen

A. cherimola "chirimoya ó cherimoya" y A. muricata "guanábana, graviola ó soursop" son árboles frutales, semicaducifolios, nativos de las regiones cálidas de los Andes y de algunas áreas del caribe trópical de acuerdo a su origen. Estas especies son potencialmente promisorias a nivel mundial, no sólo en el mercado de las frutas tropicales, sino también en la industria de alimentos procesados. Los compuestos fitoquímicos de sus hojas, tallos y flores tienen una destacada aplicación en la fitomedicina y en la industria de productos cosméticos Ambas especies son localmente conocidas en los países de América Latina de donde son originarias, y los desarrollos científicos aplicados son de orígen reciente. La exploración, colección, conservación, evaluación y divulgación de genotipos naturales de A. cherimola y A. muricata en los países donde son especies reconocidas en la Flora Nativa, tales como Colombia, Perú, Ecuador, Venezuela y El Salvador, es una prioridad en términos de redescubrimiento y conservación de germoplasma nativo. La propagación por semilla de A. cherimola y A. muricata induce un alto grado de variación genética. Igualmente si un método convencional de propagación vegetativa es aplicado, las características hermafroditas de la flor y su comportamiento dicógamo-protogíneo, promueven el cruce entre individuos ó selecciones. Por lo tanto, la conservación de numerosos genotipos "élite" a través de los metodos tradicionales de propagación es una utopía, no sólo en los países centros de orígen, sino en aquellos donde han sido introducidas y adaptadas a microclimas específicos como es el caso de España, Australia, California, Chile y algunas regíones en Asia. El presente estudio presenta una revisión y compilación de la información relevante en áspectos botánicos y culturales, que han sido publicados, de manera aislada, sobre la A. cherimola y la A. muricata a nivel mundial. Debido a los problemas para propagar y conservar material élite de A. cherimola y A. muricata, el primer objetivo de éste estudio, aplicando la técnica del cultivo de tejidos vegetales, ha sido desarrollar protocolo que permita la indución y propagación in vitro de estas especies, asegurando la preservación de los genotypos naturales o iniciales, es decir, no modificando la estabilidad genética del material micropropagado "true-to-type". A. cherimola y A. muricata son especies que han sido clasificadas como recalcitrantes o difíciles de ser propagadas in vitro debido a los problemas de remanentes de contaminación y oxidación. La clonación in vitro se inició con la identificación del explante inicial en edad, tamaño y ubicación en la planta que permite, no sólo en un 95%, controlar la típica contaminación y fenolización inicial que limitan las subsecuentes etapas del cultivo in vitro. Estacas de árboles de 4 años de edad, con yemas preformadas fueron estimuladas a inducir en condiciones in vitro la proliferación de cuatro nuevos brotes por yema en un tiempo de cinco semanas. El effecto de Rifampicina, antibiótico de amplio espectro, en la contaminación endógena del explante, y el efecto de compuestos anti-oxidantes para facilitar el establecimiento aséptico y supervivencia del explante son discutidos. Este estudio no reporta diferencias metódicas en el establecimiento de A. cherimola y A. muricata en condiciones in vitro. En la etapa de proliferación de brotes in vitro la A. muricata es menos proliferante que la A. cherimola a nivel de desarrollo e inducción de nuevos brotes laterales. Concentraciones de ácido giberélico permiten la elongación de entrenudos en A. muricata con una tasa de proliferación de 1:6 explantes por subcultivo. Los brotes de A. cherimola proliferan bien, si el medio de cultivo es suplementado con zeatina y kinetina de 1:7 explantes por subcultivo en termino de cuatro semanas. Durante la micropropagación tanto A. cherimola como A. muricata presentaron una clorosis in vitro y decaimiento total del explante. De acuerdo con la sintomatología, la formulación del medio de cultivo de Nitsch-Nitsch (1969) fue revisado, y los resultados confirmaron una deficiencia de nitrógeno, el cual fue incrementado de 20.6 ?M a 39.4 ?M en ambos tipos de suplementación química, amonio y nitrato. Este estudio reporta que tanto A. cherimola como A. muricata requieren en la etapa de proliferación una mayor suplementación de nitrógeno. La concentración reportada por Murashige-Skoog (1962) fue la más adecuada para proliferar explantes de alta calidad El enraizamiento clonal de A. cherimola y A. muricata ha sido reportado esporádicamente tanto en condiciones in vitro como ex vitro. Este estudio revela que tanto la inducción y desarrollo de raíces esta relacionado con los contenidos endógenos de reguladores de crecimiento. Estas especies están en la etapa de proliferación in vitro, están somentidas a niveles altos de concentración de citoquininas exógenas, los contenidos altos de nitrógeno que se requieren en la etapa de multiplicación indican una alta activida fotosintética y metabólica endógena cuyos niveles pueden estar inhibiendo la formación de raíces. Explantes de A. cherimola y A. muricata fueron precondicionados para inducir raíces en medio de cultivo con reducción de sales y azúcar por un tiempo mínimo de seis semanas sin ninguna suplementación hormonal. Pasado este tiempo los explantes reaccionan a la concentración de ácido-indol-butirico 1%, tanto en presentación comercial como análitica con una eficiencia de 55.5% y 45.6% de plantúlas enraizadas respectivamente. El enraizamiento ex vitro presenta el mayor porcentaje de brotes con raiz inducida con mayores probabilidades de endurecimiento y adaptación a las condiciones ex vitro ó de invernadero. Haciendo uso de la técnica "Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)" se evacuo la estabilidad genética de las selecciones regenerantes in vitro de A. cherimola y A. muricat. 29 primers fueron evaluados, de ellos 6 fueron seleccionados por su patrón de repetición en ambas especies y seleciones. Los resultados confirmaron la estabilidad genética de las plantas micropropagadas de acuerdo a los primers seleccionados. Esta investigación presenta por primera vez, hasta donde es conocido un protocolo que permite la propagación clonal in vitro de A. cherimola y A. muricata, el cual es confirmado por la técnica molecular RAPD. Con éste protocolo se pueden regenerar y propagar árboles selectos de A. cherimola y A. muricata y conservar la estabilidad genética de los mismos, resultado de gran importancia en términos de conservación de la diversidad natural.

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Bibliographical Information:

Advisor:

School:Humboldt-Universität zu Berlin

School Location:Germany

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Microvermehrung Annona spp. Micropropagation Tropical Fruits Micropropagación WL 8040

ISBN:

Date of Publication:03/24/2000

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