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Mechanisms generating biliary lipid specificity lipid transport in the apical and basolateral domain of the plasma membrane of differentiated HepG2 cells

by Tannert, Astrid

Abstract (Summary)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Prozessen der Lipidanreicherung in der Gallenflüssigkeit. Leberzellen (Hepatozyten) sind polare Zellen, die für die Sekretion der Gallenflüssigkeit verantwortlich sind. Die Anbindung an den Blutkreislauf besteht über die basolaterale Membran. Durch die gegenüberliegende, sogenannte apikale Membran werden zwischen benachbarten Leberzellen tubuläre Stukturen (bile canaliculi, BC) gebildet, in die die Gallenflüssigkeit abgesondert wird. Daher wird diese Membran auch als Canalicularmembran (CM) bezeichnet. Die Gallenflüssigkeit besitzt hinsichtlich ihrer Lipidzusammensetzung eine bemerkenswerte Spezifität. Obwohl der Anteil von Phosphatidylcholin (PC) an den Phospholipiden der CM nur 35% beträgt, macht es 95% der Phospholipide der Gallenflüssigkeit aus. Mögliche Mechanismen, die zur Spezifität der Lipidsekretion in die Gallenflüssigkeit führen, werden untersucht und diskutiert. Phospholipide werden aus der äußeren Lamelle der CM durch Gallensalze herausgelöst. Die Wechselwirkung von Gallensalzen mit Phospholipiden ist kopfgruppenunspezifisch. Eine Solubilisierung von Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) durch Gallensalze könnte durch die Wirkung einer Aminophospholipidtranslokase (APLT) verhindert werden, die diese Lipide aktiv auf die zytoplasmatische Seite der Membran pumpt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Versuche durchgeführt, um die Aktivität einer APLT in der CM nachzuweisen. Dabei wurde die Hepatomazelllinie HepG2 eingesetzt, die in der Lage ist, Canalicularvakuolen (BC) zu bilden. Zunächst wurde die Einwärtsbewegung einer Reihe fluoreszierender Lipidanaloga mit unterschiedlicher Affinität zur APLT charakterisiert. Dies geschah an der basolateralen Membran von HepG2 Zellen, wo eine APLT-Aktivität bereits bekannt ist. Die Aufnahme geeigneter APLT-Substrate konnte durch den APLT-Inhibitor Suramin reduziert werden. Ebenso wurde die Affinität eines Paares von PS-Analoga bestätigt, von denen Diether PS ein "schlechtes" und Diacyl PS ein "gutes" APLT-Substrat darstellt. Im zweiten Schritt wurde die Anreicherung der gleichen Analoga in BC von HepG2 Zellen untersucht. Es ergab sich eine auffallende Korrelation zwischen einer APLT vermittelten Aufnahme von Phospholipidanaloga an der basolateralen Membran und dem Fehlen dieser Analoga im Lumen der BC. Wenn Zellen mit Phospholipiden markiert wurden, die keine oder nur "schlechte" APLT-Substrate darstellen, erschienen die BC stark fluoreszierend. Diese Beobachtungen zeigen, dass eine APLT-Aktivität in der CM von Hepatozyten vorhanden ist, welche das Fehlen der Aminophospholipide in der Gallenflüssigkeit erklärt. Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle von MDR-Proteinen (wie MDR3) bei der Lipidsekretion in die Gallenflüssigkeit. Aufgrund bisheriger Arbeiten wird vermutet, dass MDR3 daran als spezifischer Membrantransporter für PC beteiligt ist. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene MDR-Inhibitoren die Anreicherung fluoreszierender Phospholipidanaloga in den BC von HepG2 Zellen nur wenig reduzieren. Diese Beobachtung kann unter der Annahme erklärt werden, dass MDR3 eher für die Exposition von PC an der lumenalen Seite der CM verantwortlich ist, als für den Tranport von PC über die Membran. Solche "Liftase"-Aktivität von MDR3 könnte endogenes PC der Detergenzwirkung von Gallensalzen zugänglich machen, ein Prozess, der für die hydrophileren fluoreszierenden PC-Analoga nicht nötig ist. Im dritten Teil wird die Rolle von Sphingolipiden und die Bildung von "Rafts" in der CM behandelt. Solche Membrandomänen sollten die Solubilisierung von Spingolipiden in die Gallenflüssigkeit verhindern. Eine Anreicherung fluoreszierender Sphingolipidanaloga in den BC wurde jedoch nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die verwendeten Analoga das Verhalten endogener Sphingolipide in der CM nicht korrekt wiederspiegeln. Im abschließenden Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine Methode zur Aufklärung der physikochemischen Prozesse der Lipidsekretion an der Canalicularmembran gelegt. Die starke Umgebungsabhängigkeit der Fluoreszenzlebensdauer für verschiedene fluoreszierende Lipidanaloga wurde in einer Reihe von Modellumgebungen analysiert und deren Nutzbarkeit für die Vorhersage der Lipidorganisation geprüft. Insbesondere wurde die Wechselwirkung verschiedener Gallensalze mit Lipidanaloga und der Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen verschiedenen Lipidanaloga charakterisiert. Diese Daten sind Ausgangsbasis für die mikroskopische Charakterisierung der Organisation von Lipidanaloga in den BC in vivo.
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Bibliographical Information:

Advisor:

School:Humboldt-Universität zu Berlin

School Location:Germany

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Physik, Astronomie Fluoreszenz Physik

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Date of Publication:12/18/2003

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