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Venómica. Mecanismos molecular y evolutivos de la diversificación estructural de la familia de las disintegrinas.

by Juárez Gómez, Paula

Abstract (Summary)
RESUMEN La composición proteica de los venenos de serpiente refleja el hecho de que éstos se originaron en etapas tempranas de la evolución de los reptiles escamosos, por reclutamiento y transformación por evolución acelerada de un número reducido de proteínas endógenas. Los venenos de los vipéridos poseen un arsenal de proteínas capaces de degradar la matriz extracelular e interferir en la cascada de coagulación, el sistema hemostático y la reparación de tejidos. Los proteomas de las serpientes Viperinae caracterizados hasta la fecha están constituidos por isoformas de unas pocas familias de proteínas, cuya abundancia relativa presenta gran variación interespecífica. Las proteínas mayoritarias de los venenos de las víboras y serpientes de cascabel se agrupan en enzimas (proteasas dependientes de serina, metaloproteasas dependientes de Zn2+ del grupo de las reprolisinas, isoenzimas del grupo II de fosfolipasas A2, L-amino acido oxidasa) y proteínas sin actividad enzimática (proteínas similares a lectinas dependientes de Ca2+ y disintegrinas). Las disintegrinas (40-100 AAs) son liberadas al veneno por procesamiento proteolítico de las metaloproteasas PII y actúan inhibiendo la adhesión de las integrinas a sus ligandos. Se clasifican en función de su longitud y número de enlaces disulfuro en monoméricas largas (~90 AAs, 7 SS), medias (~70 AAs, 6 SS) y cortas (~ 40 AAs, 4 SS) y diméricas (subunidades de ~ 63 AAs, 2 SS Inter.- y 4 SS intracatenarios). El objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en el estudio de las bases moleculares de la diversificación estructural y funcional de la familia de las disintegrinas. Partimos de un esquema evolutivo basado en la pérdida sucesiva de enlaces disulfuro (ingeniería de enlaces disulfuro) y la acumulación de mutaciones (química combinatorial) en el bucle de inhibición de integrinas. La aplicación de técnicas proteómicas nos ha permitido determinar la composición proteica del veneno crudo de Sistrurus m. barbouri, Echis ocellatus y Bitis arietans. Para ello los venenos se fraccionaron por RP-HPLC y cada una de estas fracciones fue analizada por SDS-PAGE, secuenciación N-terminal, determinación de masa molecular, contenido en cisteínas libres, enlaces disulfuro y huella peptídica por espectrometría de masas MALDI-TOF, además de secuenciación de novo por espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Así pudimos adjudicar cada pico obtenido tras la separación a 10-12 familias de proteínas conocidas. Con el objeto de comparar proteoma y transcriptoma e investigar la posible presencia de intermediarios evolutivos de las familias de disintegrinas no expresados en el veneno se han analizado librerías de ADNc de glándulas de venenos de Bitis arietans (Ba) y Echis ocellatus (Eo). En el caso de Ba identificamos un producto que presenta un dominio tipo disintegrina ECD con 16 cisteínas, conservando el enlace entre las CysXIII-CysXVI, pero que carece del dominio rico en cisteínas típico de las metaloproteasas PIII, lo cual indica que la deleción del dominio rico en Cys ocurrió con anterioridad a la pérdida del enlace disulfuro C13-C16. En Eo amplificamos precursores de disintegrinas diméricas, los cuales pertenecen a la clase mensajeros cortos (carecen del dominio metaloproteasa). La existencia de mensajeros que codifican para disintegrina no expresados en el veneno podría indicar la existencia de fondos de reserva genómicos de eventual relevancia para la adaptación a ecosistemas cambiantes. Además, mediante el análisis de la organización genómica de disintegrinas de las diferentes familias estructurales, hemos demostrado que la pérdida sucesiva de intrones forma parte de un mecanismo evolutivo de diversificación de las disintegrinas que conlleva una evolución acelerada y una minimización de las estructuras génica y proteica.
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Bibliographical Information:

Advisor:Calvete Chornet, Juan José; Sanz Sanz, Libia

School:Universitat de València

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:bioquímica i biologia molecular

ISBN:

Date of Publication:03/08/2007

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