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Les sérines protéases de la coagulation et leurs récepteurs "proteases-activated receptors": étude analytique de leur signalisation calcium dans une lignée endothéliale et les ostéoblastes

by Daubie, Valéry RV

Abstract (Summary)
Des résultats d’expériences cliniques de reconstruction de l’os maxillaire faites à partir de la greffe d’une "pâte osseuse" gélifiée par l’ajout de facteur tissulaire ont été le primum movens de ce travail. Cette "pâte osseuse", faite d’os en poudre et de plasma enrichi en plaquette (PRP) à laquelle on ajoute du facteur tissulaire, est un modèle à la fois de la coagulation et de la régénération osseuse. Pour analyser des effets de la coagulation, nous avons utilisé un modèle connu : la culture primaire de cellules endothéliales (HUVEC). Les effets in vitro des facteurs de coagulation, dénommés protéases de la coagulation, pris séparément, ont été bien étudiés dans ces cellules, néanmoins aucune information sur l’effet combiné de ces protéases ou du plasma en coagulation n’était connue. Nous avons mesuré la "signalisation calcium" comme réponse cellulaire aux différents agents et ces mesures de la signalisation calcium ont été complétées par la mesure d’une autre réponse biologique, à savoir la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et IL-8). Pour l’étude de la régénération osseuse, la signalisation calcium a été mesurée sur une lignée d’ostéosarcomes humains (SaOS-2), stimulée par des protéases de la voie extrinsèque de la coagulation (facteur VIIa, facteur Xa et thrombine). Comme réponse biologique complémentaire, nous avons évalué l’effet des protéases d’intérêt sur l’apoptose induite par l’absence de sérum dans le milieu de culture. Les premiers travaux, réalisés sur les HUVEC, nous ont permis de montrer que le facteur Xa et la thrombine induisaient des signaux calcium différents sur ces cellules en mono couches, alors que le complexe facteur tissulaire – facteur VIIa ne provoquait aucune signalisation calcium. Nous avons également pu montrer une addition des signaux calcium induits par le facteur Xa et la thrombine. L’activation in situ du facteur Xa et de la thrombine à partir de leur zymogène a permis à la fois de confirmer les résultats précédents et de se rapprocher de l’in vivo. Finalement, au plus proche de l’in vivo, les expériences faites avec du plasma en coagulation ont également permis de détecter un signal calcium. La réponse biologique (sécrétion d’IL-6 et d’IL-8) en aval du signal calcium a confirmé les résultats calcium. En ce qui concerne la régénération osseuse étudiée à partir de SaOS-2, nous avons démontré l’expression du facteur tissulaire sur la lignée SaOS-2 et nous avons montré que le facteur VIIa, le facteur Xa et la thrombine induisaient tous des signaux calcium. Ces signaux présentaient des caractéristiques propres suivant la ou les protéase(s) utilisée(s) pour la stimulation. Les mesures ont également permis de caractériser, sur ces cellules, les récepteurs activés par les protéases d’intérêt, à savoir les "protease-activated receptors" 1 et 2 (PAR-1 et PAR-2). Comme réponse biologique, nous avons mesuré la diminution de l’apoptose induite par les protéases en absence de sérum dans le milieu de culture. Il a ainsi été montré que seule l’activation du récepteur PAR-1 permettait de diminuer l’apoptose. Finalement, nous avons caractérisé la voie suivie, qui passait par la phosphoinositide 3-kinase et la voie des MAPK Raf/MEK/ERK 1/2. En conclusion, cette thèse a permis de montrer, d’une part, que le facteur Xa et la thrombine provoquent des réponses calciques et proinflammatoires additifs dans les cellules endothéliales et, d’autre part, que le complexe facteur tissulaire – facteur VIIa, le facteur Xa et la thrombine induisent des signaux calcium caractéristiques dans les ostéosarcomes par l’activation des récepteurs PAR, l’activation de PAR-1 diminuant l’apoptose induite par l’absence de sérum dans le milieu de culture.
Bibliographical Information:

Advisor:Pradier Olivier; Boeynaems Jean-Marie; Robberecht Patrick; Lebrun Philippe; Pochet Roland; Hermans Emmanuel; Dupont Geneviève

School:Université libre de Bruxelles

School Location:Belgium

Source Type:Master's Thesis

Keywords:coagulation factor tissue protease activated receptor osteoblast endothelial cell

ISBN:

Date of Publication:01/10/2008

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