Details

Kinetic studies of a xyloglucan endotransglycosylase, a key enzyme in plant cell morphogenesis

by Saura Valls, Marc

Abstract (Summary)
RESUM: El present treball de recerca semmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), lobjectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat daquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cellulosa, estudiant el seu mecanisme dacció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball sestudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A). Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capillar (HPCE), que permet lestudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per lequip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Es determina que el màxim dactivitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que lacceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a lenzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de lacceptor, unint-se als subsetis positius de lintermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o lelongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en lextrem no reductor. Savalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per lequip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. Daquesta forma saprofundeix en el coneixement de lactivitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en lestabilització de lestat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per lenzim estudiat. Finalment, sha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no sha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador shan perdut en el procés de síntesis del substrat.
This document abstract is also available in English and Spanish.
Bibliographical Information:

Advisor:Planas Sauter, Antoni

School:Universitat Rovira i Virgili

School Location:Spain

Source Type:Master's Thesis

Keywords:iqs química orgànica i bioquímica

ISBN:

Date of Publication:09/28/2007

© 2009 OpenThesis.org. All Rights Reserved.