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Functional analysis of phototropin in Chlamydomonas reinhardtii

by Lu, Yinghong

Abstract (Summary)
In h?heren Pflanzen vermittelt der Blaulicht-sensitive Photorezeptor Phototropin verschiedene Reaktionen wie Phototropismus, Chloroplastendrehung und die ?ffnung von Schlie?zellen. Alle Reaktionen haben mit der Optimierung der pflanzlichen Lichtaufnahme und damit einer angepa?ten Photosynthese sowie der Vermeidung von Lichtsch?digung zu tun. In C.reinhardtii haben alle Phototropinreaktionen mit dem Sexualleben dieser Alge zu tun, d.h. Gametogenese, sexueller Kompetenz sowie der Keimung von Zygoten. Diese Doktorarbeit wurde Ende 2001 begonnen und verlief parallel zu den Arbeiten von Huang. Im Unterschied zu den Ergebnissen von Huang war das Chlamydomonas Phototropin in meinen H?nden unl?slich. Das Protein war nicht komplett membranassoziiert, sondern ein Teil des Proteins blieb immer l?slich. Die Phototropinmenge sowie die Verteilung waren in vegetativen Zellen, die unter Stark- oder Schwachlicht gewachsen waren, unterschiedlich. Deshalb wurde fš¹r diesen Unterschied Licht als wesentlicher Faktor verantwortlich gemacht. Jedoch zeigen verschiedene St?mme bei vegetativem Wachstum unter identischen Lichtbedingungen unterschiedliche Phototropinmengen. Das deutet auf weitere Faktoren hin, die Konzentration und Verteilung von Phototropin beeinflussen. In Chlamydomonas wurde neben dem Volll?ngenprodukt noch eine c-terminal verkš¹rzte Phototropinvariante gefunden. Licht wurde als Verursacher der Verkš¹rzung identifiziert. Aber nur lange Belichtungen von ca. 48 h fš¹hrten je nach Intensit?t zu klaren Abbaumustern. Fš¹r das Studium der Beteiligung des Phototropins am Sexualleben von Chlamydomonas, sollte ein Phot- Stamm generiert werden. Dazu wurde ein RNAi-Konstrukt hergestellt, mit dem es m?glich war, im Stamm cw15 arg- A das Phototropin bis auf 10% des Originalniveaus zu reduzieren. Leider funktionierte das Konstrukt in anderen St?mmen nicht zuverl?ssig. Im Stamm CC32pab1mt(+) konnte nur ein Klon mit einer Reduktion auf 15% des Originalniveaus erreicht werden. Au?erdem war die Silencing-Effizienz stark von den Wachstumsbedingungen abh?ngig. Die beste Reduktion wurde bei niedrigen Lichtintensit?ten gefunden. Es wurde ein weiterer Kreuzungstest etabliert, der fš¹r die Analyse der Zygotenkeimung verschiedene Vorteile gegenš¹ber bekannten Tests liefert. Aus den durchgefš¹hrten Tests konnte geschlossen werden, dass Licht auch ein wesentlicher Faktor fš¹r die Zygotenkeimung ist. Bei mittleren Lichtintensit?ten keimen Zygoten mit wenig Phototropin sp?ter. Starklicht kann diesen Mangel weitgehend kompensieren. Zur biochemischen Analyse des Phototropins in vitro war die Expression eines markierten Phototropins notwendig. Zur Analyse des Phototropinabbaus und fš¹r die sp?tere Reinigung wurde auch versucht, Phototropin in verschiedenen Gastorganismen zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde Phototropin in Xenopus Oocyten und Diatom?en exprimiert. Diese Versuche haben best?tigt, dass das Phototropinabbauprodukt vom selben Gen wie das Volll?ngenprotein resultiert. Durch Expression der Phot-Mutante S57S/C250S konnte auch gezeigt werden, dass die Aktivierung des Phototropins keine Voraussetzung fš¹r den Abbau ist. Erstmalig konnte auch Phototropin als Fusionsprotein in Chlamydomonas exprimiert werden. Das Fusionsprotein wurde gereinigt und die Identit?t massenspektrometrisch verifiziert. Es wurde ein Stamm gefunden, der nur eine verkš¹rzte Variante des Phototropins exprimiert. Das Produkt war besser l?slich als die Volll?ngenversion. Eine Gro?produktion sollte fš¹r die Reinigung und nachfo! lgende Kristallisation angesetzt werden. Tandem Affinit?tsreinigungen sollten fš¹r die Identifizierung von Reaktionspartnern durchgefš¹hrt werden.
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Bibliographical Information:

Advisor:

School:Humboldt-Universität zu Berlin

School Location:Germany

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Biowissenschaften, Biologie

ISBN:

Date of Publication:09/08/2006

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