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Etude du rôle des sites de liaison AP-1 intragéniques dans la régulation de l'expression du HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus type 1)

by Vandenhoudt, Nathalie

Abstract (Summary)
La vitesse de réplication du HIV-1(Human Immunodeficiency Virus type 1), qui semble corrélée de manière directe à la vitesse de progression de la maladie vers le stade SIDA, est essentiellement contrôlée au niveau transcriptionnel. La transcription du HIV-1 est régulée par la structure chromatinienne, des éléments agissant en cis localisés dans les LTRs, des facteurs de transcription agissant en trans et par la protéine virale trans-activatrice Tat (revu dans Quivy et al. 2007, Bisgrove et al. 2005, Rohr et al. 2003, Rabson and Graves 1997). En plus de l’enhancer localisé dans le LTR5’ du HIV-1, un enhancer intragénique, localisé dans le gène pol du HIV-1, inductible par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) a été identifié. La localisation progressive de l’activité enhancer a permis de définir deux domaines distincts et indépendants dans cet enhancer intragénique : les fragments 5103 et 5105 localisés respectivement dans la partie centrale du gène pol et dans une région couvrant la fin du gène pol, le gène vif, le gène vpr et le premier exon codant des gènes tat et rev (Verdin et al. 1990). Les fragments 5103 et 5105 se comportent tous deux comme des enhancers inductibles par le PMA lorsqu’ils sont clonés en amont du promoteur de la thymidine kinase dans un vecteur rapporteur en cellules HeLa. Notre laboratoire a précédemment identifié trois sites de liaison pour les facteurs de transcription AP-1 dans le fragment 5103 (Van Lint et al., 1991). Au cours de notre thèse, nous avons poursuivi la caractérisation de ces sites de liaison AP-1 et avons montré que les facteurs c Fos, JunB et JunD interagissent in vitro avec ces motifs. Pour chaque site, nous avons identifié des mutations qui abolissent la liaison des facteurs AP-1 sans altérer la séquence en acides aminés sous-jacente de la transcriptase inverse. Par des expériences de transfection transitoire, nous avons démontré que les sites AP 1 intragéniques sont entièrement responsables de l’activité enhancer PMA-dépendante du fragment 5103. De plus, l’activité PMA-inductible du fragment 5103 est inhibée par le mutant dominant négatif A-Fos à condition que les sites ne soient pas mutés. A l’inverse, l’expression ectopique de dimères forcés AP-1 affecte positivement l’activité enhancer du fragment 5103. Enfin, nous avons étudié le rôle biologique des sites AP-1 intragéniques dans la réplication virale et avons montré que ces sites contribuent positivement à l’infectivité du virus. Durant la seconde partie de notre thèse, nous avons entamé la caractérisation physique et fonctionnelle du fragment 5105. Nos résultats de transfection transitoire montrent que l’activité PMA inductible du fragment 5105 est localisée dans le dernier tiers de ce dernier : le sous fragment 5105.3. L’analyse bioinformatique de cette région a permis de mettre en évidence un site de liaison pour les facteurs AP-1 in vitro. Des mutations ponctuelles permettent d’abolir la liaison des facteurs à leur site mais altèrent la séquence en acides aminés sous-jacente codant pour les protéines Tat et Rev. Nous avons montré que ce site est impliqué dans l’activité transcriptionnelle de ce fragment. L’expression ectopique du mutant dominant négatif A-Fos inhibe l’activité transcriptionnelle PMA-inductible du fragment 5105. Une analyse bioinformatique plus large nous a ensuite permis d’identifier in vitro, par retard de migration sur gel, 5 sites de liaison pour le facteur YY1 et 2 sites de liaison pour le facteur PU.1 dont les implications pour le virus restent encore à déterminer.
Bibliographical Information:

Advisor:Vanhamme, Luc; Pays, Etienne; Van Lint, Carine; Robaye, Bernard; Marini, Anna-Maria; Rohr, Olivier

School:Université libre de Bruxelles

School Location:Belgium

Source Type:Master's Thesis

Keywords:transcription hiv 1 ap

ISBN:

Date of Publication:06/26/2009

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