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Etude de l'épissage d'une intéine de Synechocystis PCC6803 insérée dans la bêta-lactamase TEM-1

by Brédo, Anne

Abstract (Summary)
Les intéines sont des éléments protéiques qui sont excisés d'une séquence polypeptidique par un processus autocatalytique appelé épissage. Les intéines monomériques ou dimériques effectuent respectivement des réactions d'épissage intra- et intermoléculaires. L'objectif du travail est de mettre au point une technique pour la création de banques de mutants de grandes tailles en combinant deux banques de fragments protéiques. La protéine monomérique est restaurée par épissage d'une intéine dimérique. Comme les déterminants qui permettent l'épissage des intéines ne sont pas encore bien connus, il a été décidé d'étudier l'épissage d'une intéine introduite dans la bêta-lactamase. Des collections de mutants ont été construites et caractérisées par sélection in vivo. Parmi les clones sélectionnés tolérant l'insertion de l'intéine, mais incapables d'épisser, un grand nombre présentent, à la jonction N-terminale, deux cystéines de part et d'autre de la liaison peptidique à cliver. L'hypothèse est que la liaison entre les deux cystéines se trouve dans une conformation non coplanaire permettant ainsi la formation d'un pont disulfure entre ces deux résidus. Cette conformation est probablement imposée par l'intéine de manière à déstabiliser la liaison peptidique et à favoriser ainsi son clivage dans le mécanisme d'épissage. D'autre part, les mutants capables d'épisser possèdent tous une glycine du côté N-terminal de l'intéine et une sérine du côté C-terminal de l'intéine. Ces deux acides aminés sont donc les seuls requis pour permettre un épissage efficace. Afin de déterminer si l'épissage intermoléculaire est possible, une des enzymes sélectionnées a été fragmentée au niveau de l'intéine. Bien qu'aucun produit d'épissage n'ait été détecté par Western Blot, une faible activité bêta-lactamase in vivo permet de supposer que l'épissage a eu lieu.
Bibliographical Information:

Advisor:

School:Université catholique de Louvain

School Location:Belgium

Source Type:Master's Thesis

Keywords:sélection bêta lactamase epissage extéine intéine

ISBN:

Date of Publication:02/01/2005

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