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Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen

by Siraj, Hassen

Abstract (Summary)
Das Hamsterpolyomavirus (HaPV) wurde aus Hauttumoren von HaPV-infizierten Hamstern isoliert und gereinigt. Die Virionen sind ca. 45 nm groß und sind durch einen Polyomavirus-typischen ikosaedrischen Aufbau gekennzeichnet. Im Gegensatz zu den Kapsiden anderer Polyomaviren zeigen sie jedoch eine T=7-laevo Symmetrie. Die Analyse der Proteinzusammensetzung zeigte, daß das HaPV-Kapsid hauptsächlich aus drei Virus-kodierten Strukturproteinen (VP1, VP2 und VP3) besteht. Das VP1 repräsentiert ca. 71% des Gesamtkapsidproteins und stellt somit das Hauptkapsidprotein dar. Die Vorher-sage des VP1-ORF ergab 2 in-frame befindliche potentielle Translationsinitiationssignale (ATG), die zur Synthese von VP1-abgeleiteten Proteinen von 384 und 388 Aminosäuren füh-ren sollten. Die Sequenzierung des N-Terminus des viralen VP1 ergab, daß die Translations-initiation am 2. ATG des VP1-ORF erfolgt, so daß das authentische VP1 384 Aminosäuren beinhaltet (MG: ca. 41,8 kDa). Das authentische und das N-terminal verlängerte VP1 wurden in Insektenzellen zur Expres-sion gebracht. Die Proteine reagierten im Western blot mit HaPV-VP1-spezifischen Kanin-chenseren und Seren von HaPV-infizierten Hamstern. Beide VP1-Derivate sind in der Lage, in Insektenzellen Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Diese Partikel ähneln in ihrer Dichte und Struktur leeren HaPV-Virionen. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen und Zell-fraktionierung konnte die nukleare Lokalisation der Partikel in Insektenzellen gezeigt werden. Durch Behandlung der Partikel mit EGTA/DTT lassen sich die Partikel in Pentamere dissozi-ieren. Möglicherweise können die Partikel durch Dissoziation und anschließende Reassozia-tion mit fremder Nukleinsäure beladen werden, um für gentherapeutische Anwendungen ein-gesetzt zu werden. Zur Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im VP1 wurde die dreidimen-sionale Struktur des HaPV-VP1 auf der Basis verwandter Polyomaviren vorhergesagt und eine Epitopkartierung mit Hilfe in E. coli exprimierter rekombinanter VP1-Derivate und syn-thetischer Peptide durchgeführt. Die Vorhersage der Struktur ergab 5 oberflächenexponierte Regionen: As 81-88, As 222/223, As 244-246, As 289-294 und die C-terminale Region von VP1. Zwei der genannten Regionen (As 79-97 und die C-terminale Region von VP1) konnten bei beiden Epitopkartierungsstudien als Epitope identifiziert werden. Wahrscheinlich sind in der C-terminalen Region (As 320-384) sowohl lineare als auch mindestens ein diskontinuier-liches Epitop lokalisiert. Diese Region ist auch die Ursache für die Kreuzreaktivität von HaPV-VP1 mit anti-SV40- und anti-JCV-positiven Seren. Aufgrund der wichtigen Funktion der C-terminalen Region beim Virus-Assembly kann diese Region wahrscheinlich nicht als Insertionsort für Fremdsequenzen verwendet werden, während die Region As 84-87 für die Insertion von Fremdproteinsequenzen geeignet sein sollte.
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Bibliographical Information:

Advisor:

School:Humboldt-Universität zu Berlin

School Location:Germany

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Chemie Vakzine virus-ähnliche Partikel rekombinante Proteine

ISBN:

Date of Publication:06/21/2000

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