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Estudos de expressão do HBsAg: hepatite B oculta, genótipos do HBV e quimeras de HBV e HCV.

by de Araújo, Natalia Motta

Abstract (Summary)
Introdução: O vírus da hepatite B (HBV) é classificado em oito genótipos (A-H), que apresentam uma distribuição geográfica característica nas diferentes regiões do mundo. No Brasil, são encontrados principalmente os genótipos A, D e F. A infecção pelo HBV é comumente diagnosticada pela presença do antígeno de superfície viral (HBsAg) no soro de indivíduos infectados. Mutações no HBsAg podem afetar os níveis de secreção deste antígeno, bem como, alterar a sua conformação, e conseqüentemente, inibir a sua detecção pelos testes imunoenzimáticos. A detecção do DNA viral em pacientes com sorologia negativa para o HBsAg caracteriza a ocorrência de infecção oculta pelo HBV. Partículas híbridas de HBsAg, também denominadas quimeras, têm sido utilizadas com bastante eficiência na apresentação de epítopos exógenos. Objetivos: Realizar estudos de expressão in vitro do HBsAg em células eucarióticas visando (i) associar infecção oculta pelo HBV com mutações de aminoácidos no HBsAg; (ii) avaliar possíveis diferenças na detecção do HBsAg relacionadas aos diferentes genótipos do HBV; e (iii) possibilitar a construção de quimeras de HBV e do vírus da hepatite C (HCV) para produção de proteínas híbridas imunizantes. Metodologia: A clonagem das regiões genômicas do envelope do HBV foi realizada utilizando-se os vetores de expressão em células eucarióticas pcDNA3 e/ou pCI. Para a inserção do segmento de HCV no HBsAg, foi utilizado um sítio de restrição natural localizado na região do epítopo neutralizante do HBsAg. Ensaios de transfecção transitória foram realizados em células CHO e/ou HuH7. O meio de cultura e os extratos celulares foram analisados quanto à detecção de HBsAg por ensaios imunoenzimáticos. Ensaios de imunofluorescência, utilizando um anticorpo monoclonal anti-HBs, foram realizados para detectar a localização intracelular do HBsAg. Resultados: 1) A infecção oculta pelo HBV foi detectada em 6/43 (14%) pacientes infectados pelo HIV. A ocorrência de hepatite B oculta não teve relação com a elevação dos níveis de transaminases, porém foi significativamente associada à presença de infecção pelo HCV. Todos os pacientes, exceto um, apresentaram baixa carga viral para o HBV. O sequenciamento da região S revelou mutações em dois pacientes que podem ser responsáveis pela falta de detecção do HBsAg pelos testes comerciais. 2) O genótipo A apresentou os maiores níveis de detecção de HBsAg em comparação aos genótipos D (redução de 37%) e F (redução de 30%). Entretanto, a presença de duas únicas substituições (T143M, em um clone do genótipo A, e T125M, em um clone do genótipo D) alterou consideravelmente os níveis de detecção do HBsAg. 3) Uma mutação identificada na porção carboxi-terminal da proteína S do HBsAg no resíduo 215 (L215Q), em um isolado de HBV do genótipo F, foi responsável pela inibição da secreção deste antígeno. Através de microscopia de imunofluorescência, foi observada uma localização intracelular do HBsAg mutante indicativa de retenção no retículo endoplasmático. 4) A inserção de um segmento do HCV dentro do epítopo neutralizante do HBsAg através de um sítio natural de restrição, não alterou os padrões de secreção e a antigenicidade do HBsAg quimérico. Conclusões: A detecção de mutações no HBsAg e a baixa viremia do HBV confirmam que mecanismos multifatoriais estão envolvidos na infecção oculta pelo HBV. Mutações únicas no HBsAg podem ter mais influência nos padrões de detecção e secreção do HBsAg do que o conjunto total de variações características de cada genótipo. A utilização do sítio de restrição natural identificado neste estudo para a inserção de epítopos do HCV não alterou as propriedades antigênicas do HBsAg.
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Bibliographical Information:

Advisor:Selma de Andrade Gomes

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Vírus da Hepatite B Antígenos Mutação

ISBN:

Date of Publication:07/11/2008

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