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Estudo do Segmento Consenso Adjacente ao Domínio TM2 e parte do Domínio TM2 do Receptor P2X7: Dinâmica Molecular e Atividade de Canal Iônico.

by Magalhães de, Cristina Alves

Abstract (Summary)
Os receptores purinérgicos do subtipo P2X7 (P2X7R) são proteínas de membrana que formam canais em resposta ao ATP extracelular. Permitem a passagem de cátions através da membrana celular, sendo expressos, preferencialmente, em células do sistema imune. Além disso, o P2X7R possui características bastante distintas dos demais subtipos da família P2X (P2XR) como, por exemplo, o domínio C-terminal mais longo e a capacidade de formar um grande poro citolítico que permite a passagem de moléculas de até 900 Da, sob ativação prolongada de ATP. Apesar dos vários estudos para a elucidação dos mecanismos de formação do poro associado a esses receptores, nenhum dado conclusivo foi publicado. O mesmo ocorrendo com sua estrutura molecular. Entretanto, alguns autores sugerem que o segmento M2 dos P2XRs, mais especificamente a região prevista como uma amp;#61537;-hélice transmembrana (TM2), não poderia estar configurada apenas como uma amp;#61537;-hélice, e sendo ainda esta região responsável pela seletividade desses canais. Outros autores demonstraram, através de ferramentas de bioinformática, que os P2XRs estariam configurados preferencialmente em folha amp;#61538; e voltas. Nesse contexto, analisamos o segmento M2 e a região desse segmento composta por resíduos consensos (entre todos os subtipos de P2XRs) adjacentes ao TM2 do P2X7R de humano e parte do mesmo (peptídeo ADSEG) por programas de bioinformática. Os resultados das predições de bioinformática confirmaram os dados descritos na literatura de que o segmento M2 não estaria apenas configurado com estruturas em amp;#61537;-hélice, mas também em folhas amp;#61538;. Com relação ao peptídeo ADSEG as predições de bioinformática e de dinâmica molecular foram confirmadas experimentalmente por dicroísmo circular. Onde esse segmento também estaria configurado preferencialmente em folha amp;#61538;. Com o objetivo de testar se esse peptídeo e o P2X7R recombinante formariam canais ou ?poro citolítico?, utilizamos bicamada lipídica artificial e ?patch-clamp?. A proteína recombinante do P2X7R não formou canal em bicamada lipídica artificial. Entretanto, quando o peptídeo foi incorporado à bicamada lipídica planar, houve a formação de canais iônicos com condutância de 25,1 pS amp;#61617; 0,2 (150 mM KCl) e 14,0 pS amp;#61617; 0,1 (NaCl 150 mM). Sendo cátion seletivos e mais permeáveis ao KCl (PK+/PCl- = 9/1) do que ao NaCl (PNa+/PCl- = 4/1) e voltagem independentes entre -90 e +90 mV. O tempo médio de abertura desses canais foi londo (1,025 s amp;#61617; 0,115 em 2,5 mM KCl), compatível com os canais do P2X7R. Íon monovalente, como o NMDG+, de alto peso molecular inibiu drasticamente a condutância desses canais (12,4 pS para 4,7 pS). Cátions divalentes como o Mg2+ mostrou também inibir a condutância desses canais (17,8 pS para 12,1 pS). Um perfil semelhante foi observado quando o peptídeo ADSEG foi avaliado em ?patch-clamp?, em células HEK 293, onde os canais apresentaram condutância de 9,9 pS (150 mM KCl). Nossos dados mostram, pela primeira vez, que o peptídeo ADSEG, configurado como uma folha amp;#61538;, apresenta grande probabilidade de estar compondo estruturalmente o canal iônico dos P2X7Rs, podendo participar do filtro de seletividade do canal e compor parte da parede do canal formado pelo segmento M2. Além disso, coloca em dúvida o paradigma que o canal ou poro citolítico do P2X7R seria formado por estruturas em amp;#61537;-hélice.
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Bibliographical Information:

Advisor:Luiz Anastácio Alves

School:Faculdades Oswaldo Cruz

School Location:Brazil

Source Type:Master's Thesis

Keywords:Bicamadas Lipídicas Técnicas de Patch-Clamp Canais Iônicos BIOLOGIA MOLECULAR

ISBN:

Date of Publication:08/27/2007

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