Estudo do Segmento Consenso Adjacente ao Domínio TM2 e parte do Domínio TM2 do Receptor P2X7: Dinâmica Molecular e Atividade de Canal Iônico.

by Magalhães de, Cristina Alves

Os receptores purinérgicos do subtipo P2X7 (P2X7R) são proteínas de membrana que formam canais em resposta ao ATP extracelular. Permitem a passagem de cátions através da membrana celular, sendo expressos, preferencialmente, em células do sistema imune. Além disso, o P2X7R possui características bastante distintas dos demais subtipos da família P2X (P2XR) como, por exemplo, o domínio C-terminal mais longo e a capacidade de formar um grande poro citolítico que permite a passagem de moléculas de até 900 Da, sob ativação prolongada de ATP. Apesar dos vários estudos para a elucidação dos mecanismos de formação do poro associado a esses receptores, nenhum dado conclusivo foi publicado. O mesmo ocorrendo com sua estrutura molecular. Entretanto, alguns autores sugerem que o segmento M2 dos P2XRs, mais especificamente a região prevista como uma amp;#61537;-hélice transmembrana (TM2), não poderia estar configurada apenas como uma amp;#61537;-hélice, e sendo ainda esta região responsável pela seletividade desses canais. Outros autores demonstraram, através de ferramentas de bioinformática, que os P2XRs estariam configurados preferencialmente em folha amp;#61538; e voltas. Nesse contexto, analisamos o segmento M2 e a região desse segmento composta por resíduos consensos (entre todos os subtipos de P2XRs) adjacentes ao TM2 do P2X7R de humano e parte do mesmo (peptídeo ADSEG) por programas de bioinformática. Os resultados das predições de bioinformática confirmaram os dados descritos na literatura de que o segmento M2 não estaria apenas configurado com estruturas em amp;#61537;-hélice, mas também em folhas amp;#61538;. Com relação ao peptídeo ADSEG as predições de bioinformática e de dinâmica molecular foram confirmadas experimentalmente por dicroísmo circular. Onde esse segmento também estaria configurado preferencialmente em folha amp;#61538;. Com o objetivo de testar se esse peptídeo e o P2X7R recombinante formariam canais ou ?poro citolítico?, utilizamos bicamada lipídica artificial e ?patch-clamp?. A proteína recombinante do P2X7R não formou canal em bicamada lipídica artificial. Entretanto, quando o peptídeo foi incorporado à bicamada lipídica planar, houve a formação de canais iônicos com condutância de 25,1 pS amp;#61617; 0,2 (150 mM KCl) e 14,0 pS amp;#61617; 0,1 (NaCl 150 mM). Sendo cátion seletivos e mais permeáveis ao KCl (PK+/PCl- = 9/1) do que ao NaCl (PNa+/PCl- = 4/1) e voltagem independentes entre -90 e +90 mV. O tempo médio de abertura desses canais foi londo (1,025 s amp;#61617; 0,115 em 2,5 mM KCl), compatível com os canais do P2X7R. Íon monovalente, como o NMDG+, de alto peso molecular inibiu drasticamente a condutância desses canais (12,4 pS para 4,7 pS). Cátions divalentes como o Mg2+ mostrou também inibir a condutância desses canais (17,8 pS para 12,1 pS). Um perfil semelhante foi observado quando o peptídeo ADSEG foi avaliado em ?patch-clamp?, em células HEK 293, onde os canais apresentaram condutância de 9,9 pS (150 mM KCl). Nossos dados mostram, pela primeira vez, que o peptídeo ADSEG, configurado como uma folha amp;#61538;, apresenta grande probabilidade de estar compondo estruturalmente o canal iônico dos P2X7Rs, podendo participar do filtro de seletividade do canal e compor parte da parede do canal formado pelo segmento M2. Além disso, coloca em dúvida o paradigma que o canal ou poro citolítico do P2X7R seria formado por estruturas em amp;#61537;-hélice.